前言地方性氟中毒(endemic fluorosis，简称地氟病)是世界上、也是我国危害最严重的地方病之一，其主要的临床表现包括氟斑牙、氟骨症和氟性骨关节炎。重度地氟病患者可出现关节僵硬及运动障碍，甚至出现躯干变形和终生瘫痪，但是目前对于地氟病尚缺乏有效治疗方法的报道，只能以预防为主，而对于炎症的治疗已经比较成熟。另外，传统的观察指标氟斑牙、氟骨症尽管特异性好，但是不够敏感，也基本不可逆。炎症细胞因子C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、淋巴细胞(lymphocyte，Lc)、补体C3(complement C3，C3)和补体C4(complement C4，C4)以其敏感和可逆的特点已引起了我们的关注。CRP是由肝细胞合成的一种炎症反应蛋白，是慢性炎症状态最敏感的观察指标，血清CRP的升高提示存在长期、慢性的低度炎症状态。Lc是一种具有特异性免疫功能的白细胞，它在机体内占白细胞的百分比是相对稳定的，但当机体发生慢性炎症时，Lc的比例将增加。补体是人类或动物体液中正常存在的一组与免疫有关并具有酶活性的球蛋白，是非特异性免疫系统中极为重要的组成部分之一，参与机体的防御功能和自稳状态。C3是补体经典激活途径与旁路激活途径的中心环节。在炎症反应中，C4比C3更敏感，而且它还是补体经典激活途径的一个重要组分。补体C3、C4值的升高与降低，随机体不同的炎症状态而改变。以往对CRP的研究多集中于急性感染和慢性炎症性疾病，对Lc、C3和C4的应用也多集中于炎症反应的非特异性标志物方面，在地氟病的研究中均未见报道。本研究旨在通过动态观察亚慢性氟中毒大鼠炎症细胞因子CRP、Lc、C3和C4的表达水平，探讨慢性氟中毒过程中是否伴随有炎症反应因子水平的改变，进而为地氟病的有效治疗和寻找敏感、可逆的地氟病防治效果评价指标提供理论依据。材料和方法一、动物分组选用中国医科大学实验动物中心提供的离乳一周健康Wistar大鼠42只，雌雄各半，体重80±10克，按体重均衡原则随机分为3组，每组亦雌雄各半。喂饲全营养颗粒大鼠饲料，自由饮用不同浓度的氟化钠配置的自来水。实验周期为3个月。具体分组情况如下：对照组：饮用自来水，含F~-量为0.31 mg／L；低剂量组：饮用水中含F~-量为100mg／L；高剂量组：饮用水中含F~-量为200mg／L。二、主要试剂与仪器氟化钠、氯化钠、柠檬酸三钠、冰醋酸、氢氧化钠、盐酸、水合氯醛、多聚甲醛、无水乙醇、石蜡、苏木精、伊红，Beckman Coulter Immage配套试剂：①稀释液(硫酸钠、氯化钠、二羟甲基脲、盐酸普鲁卡因)、②清洗液(表面活性剂和蛋白酶、不含叠氮化合物)、③溶血剂Ⅰ(季铵盐、异丙醇、氰化钾)、④散射包(Ⅰ．溶血剂Ⅱ：润湿剂、甲酸[蚁酸]，Ⅱ．抑制剂：碳酸钠、氯化钠、硫酸钠)。氟离子选择电极、Beckman Coulter Immage血生化分析仪、电子天平、体重称、-70℃冰箱、光学显微镜。三、实验方法(一)标本采集及处理采用大鼠代谢笼收集隔夜尿样，用于尿氟的测定。经大鼠眼眶内眦静脉丛或腹主静脉(或右心房)采血，分离血清，用于血氟、血清CRP、Lc、C3和C4的检测。采集实验大鼠的肝脏，用于脏器病理学检查。采集大鼠胫骨，用于骨骼病理学检查。(二)肝脏、骨骼组织形态学观察样品分别为肝脏组织块和胫骨。1、石蜡切片的制作过程固定：4％多聚甲醛，4℃12h。脱水：70％、80％、90％的乙醇，依次使用4℃12h；然后采用95％的乙醇，室温40分钟；100％的乙醇，室温20分种，2次。透明：新鲜二甲苯，室温6分钟，2次。浸蜡、包埋：熔化的石蜡，60℃30分钟。切片：切成3—5μm的薄片。2、HE染色脱蜡：二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各置10分钟，100％乙醇Ⅰ、Ⅱ各置5分钟。水化：95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇各置3分钟，DDW置1分钟。苏木精染色5-10分钟。1％盐酸酒精分化数秒。水洗返蓝10-20分钟。伊红染色5-10分钟。水洗5-10分钟。脱水：75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇各置1分钟，100％乙醇Ⅰ、Ⅱ各置2分钟。透明：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各置3分钟。封片：滴加中性树胶适量，覆盖盖玻片。四、血清CRP、Lc、C3和C4水平测定采用免疫比浊法测定大鼠血清中CRP、C3和C4的水平。采用流式细胞分析法检测大鼠血清中Lc的水平。检测仪器Beckman Coulter Immage工作原理：根据流体力学的原理，应用VCS三种技术同时检测(VCS技术即容量、电导、光散射法来检测血液细胞的一种新技术)。五、大鼠氟斑牙分度方法根据以下对氟斑牙的分度方法，每隔2周检查氟斑牙的发生情况。具体分度标准如下。分度(记分)牙齿表现正常(0)釉质呈棕黄色半透明、光滑、有光泽。轻度(1)釉质变白或出现棕白相间条纹，光滑性和光泽度改变不明显。中度(2)釉质表面粗糙、无光泽，可见棕色色素沉着、浅表凹坑状缺损。重度(3)一颗以上切齿明显磨损、变短，甚至缺失。六、统计学处理采用SPSS13.0软件创建数据库，采用单因素方差分析方法和重复测量方差分析比较各组间差异。方差不齐时，采用Welch近似方差法得出F值。满足方差齐性时的两两比较采用LSD法(Least-significant Difference，最小显著差值法)，不满足方差齐性时的两两比较采用Tambane′s T2法。重复测量方差分析不满足球形检验(Mauchly′s test of sphericity)时采用Greenhouse-Geisserε校正系数来校正自由度。方差分析检验水准α=0.05，方差齐性检验水准α=0.1。七、质量控制(一)实验大鼠的饲养和实验环境的规范化，以保证实验的正常开展。(二)检测条件的控制，以保证所有仪器和辅助条件在实验期间内准确可靠，长期稳定可比；试剂在使用期间均放置在冰箱内冷藏过夜。(三)严格执行结果检测标准，动态、密切地观察检测过程各项指标的变化，剔除个体差异过大的数值。(四)标本采集操作的规范化和标本检测过程中应用盲法，避免主观因素对实验结果的影响。(五)正确应用统计学检验方法。实验结果一、大鼠氟斑牙的发生情况实验第1个月末，高剂量组有60％的大鼠出现轻度氟斑牙。实验第2个月末，高剂量组有80％的大鼠氟斑牙发生中度氟斑牙，另有6.7％的大鼠发生重度氟斑牙；同时，低剂量组有60％的大鼠发生中度氟斑牙。至染毒3个月末时，100％的染氟组大鼠出现中度氟斑牙，其中高剂量组有20％的大鼠发生重度氟斑牙。二、尿氟水平不同染氟剂量组(低剂量组或高剂量组)大鼠尿氟水平随时间的延长而增加，差别有统计学意义(F=122.796，P=0.000)，染氟剂量与测定时间之间有交互作用(F=32.490，P=0.000)；不同时间点，大鼠的尿氟水平随染氟剂量的增加而升高，差别有统计学意义(F=6427.512，P=0.000)。三、血清氟水平不同染氟剂量组(低剂量组或高剂量组)大鼠血清氟水平随时间的延长而升高，差别有统计学意义(F=78.947，P=0.000)，染氟剂量与测定时间之间有交互作用(F=19.351，P=0.000)；不同时间点，大鼠的血清氟水平随染氟剂量的增加而升高，差别有统计学意义(F=1295.079，P=0.000)。四、血清CRP水平不同染氟剂量组(低剂量组或高剂量组)大鼠血清CRP水平随时间的改变差别没有统计学意义(F=0.939，P=0.346)，染氟剂量与测定时间之间没有交互作用(F=0.965，P=0.397)；不同时间点，大鼠的血清CRP水平随染氟剂量的增加而升高，差别有统计学意义(F=8.019，P=0.009)。五、血清补体C3水平不同染氟剂量组(低剂量组或高剂量组)大鼠血清C3水平随时间的延长而降低，差别有统计学意义(F=15.118，P=0.000)，染氟剂量与测定时间之间有交互作用(F=3.488，P=0.024)；不同时间点，大鼠的血清C3水平随染氟剂量的增加而降低，差别有统计学意义(F=15.067，P=0.000)。六、血清补体C4水平不同染氟剂量组(低剂量组或高剂量组)大鼠血清C4水平随时间的延长而降低，差别有统计学意义(F=43.345，P=0.000)，染氟剂量与测定时间之间有交互作用(F=11.891，P=0.000)；不同时间点，大鼠的血清C4水平随染氟剂量的增加而降低，差别有统计学意义(F=61.688，P=0.000)。七、血清Lc水平不同染氟剂量组大鼠血清Lc水平随时间的延长而增加，差别有统计学意义(F=25.870，P=0.000)，染氟剂量与测定时间之间有交互作用(F=8.856，P=0.000)；不同时间点，大鼠的血清Lc水平随染氟剂量的增加而增加，差别有统计学意义(F=45.472，P=0.000)。八、骨组织、肝脏的形态学观察结果随染氟剂量的增加，大鼠胫骨近端骺板增生明显活跃，骨小梁数目增多、增粗，甚至出现硬化型改变；肝细胞肿胀、变性程度加重，坏死肝细胞增多。讨论一、亚慢性氟中毒大大鼠模型的制备氟斑牙是唯一可用肉眼观察到的慢性氟中毒早期临床体症，可以特异、直观地反映氟对牙组织形态结构的毒性损伤程度。实验第1个月末，高剂量组即有60％的大鼠出现轻度氟斑牙。实验第2个月末，高剂量组有80％的大鼠发生中度氟斑牙，另有6.7％发生重度氟斑牙；同时，低剂量组有60％的大鼠发生中度氟斑牙。因此本实验通过氟斑牙的观察来判定氟中毒模型的复制情况。在多次用大鼠、家兔所做的氟中毒实验中，通常2-3个月病变即发展得很充分。染氟时间延长，则有些病变反而变得不明显。原因一方面是动物对持续高氟环境有所适应；另一方面是大量原有病变进入修复阶段。因此，本次实验采用3个月的实验周期复制亚慢性氟中毒的动物模型，并每隔1个月观察1次实验动物的血清CRP、C3、C4、Lc水平改变情况，连续观察3次，以便动态掌握过量氟暴露大鼠机体细胞炎症因子水平变化的特征，观察炎症反应的发展过程。二、机体氟水平和炎症因子水平的改变在本实验中，大鼠血清氟和尿氟含量随染氟剂量增加而增加，且差别有统计学意义；但血清氟含量在3个月的染氟周期中始终保持在一个较低的水平，验证了机体通过骨氟大量沉积和尿氟加速排泄的代偿性调节，尽可能使血氟水平保持在恒定状态，以避免重要的生命脏器遭受过量氟化物的侵袭。本实验观察到大鼠血清CRP含量随染氟剂量增加而增加，在实验第1个月末时，各组间差别即有统计学意义，而此时低剂量组大鼠的氟斑牙改变并不明显，提示血清CRP水平较氟斑牙对氟的刺激可能更敏感；此后随染氟时间的延长，CRP水平逐渐升高，提示炎症状态的存在。在慢性炎症反应中，CRP的水平可以长期恒定不变，而本次实验的结果也证实了在同一染氟剂量组内，CRP的水平并不随染氟时间的延长而改变。本实验还检测到补体C3、C4均随染氟时间、剂量的增加而降低。但实验第1个月末，仅C4各组间的差别有统计学意义，实验结束时差别更明显；C3在实验第2个月末时差别才有统计学意义，验证了C4较C3敏感，也提示实验第1个月末时，即有免疫抑制的出现。过量氟可能激活经典途径及旁路途径，消耗补体，使血中补体C3、C4水平降低。另外，实验结果显示C4的改变也较氟斑牙更加敏感，它更早地表现出阳性结果，因此C4也可能作为氟中毒损伤的早期血清学标志，并且C3、C4水平的变化也提示着氟中毒发病过程中炎症反应的存在。Lc的比例随染氟剂量的增加和染氟时间的延长而增大，实验第1个月末，各组间的差别即有统计学意义，也提示机体存在慢性炎症反应。三、病理学改变本试验观察到染氟组大鼠肝组织多数区域肝细胞肿胀、变性，偶见坏死肝细胞；与以往的研究结果类似。而这些病理改变，与炎症反应的病理过程十分符合。另外，光镜下观察到染氟大鼠出现骨皮质增厚，骨小梁增生，与以往报道的X线观察到关节软骨钙化变性、坏死、软骨下骨性增生相似，同样也提示着炎症状态的存在。结论在亚慢性过量氟暴露的条件下，随染氟剂量的增加和染氟时间的延长，大鼠血清CRP、Lc水平逐渐升高，但补体C3、C4水平逐渐降低；C4比C3更加敏感。染氟第1个月末，在染氟组即出现CRP、Lc和C4水平的改变，尤其是在低剂量组，这种改变早于氟斑牙的出现。提示炎症因子CRP、Lc、C3和C4水平可能作为氟中毒所致炎症反应的血清学标志。