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目的: 酿酒酵母是单细胞生物,遗传背景比较简单,生命周期短,且分子操作简易、成本相对较低,因而成为生物学及衰老科学研究的极好模型。研究认为A型核纤层蛋白前体(prelamin A)的识别因子Narf跟细胞的衰老存在密切关系,而其在酵母中的同源基因为NAR1,推测NAR1在酵母寿命中具有一定的功能。本课题组前期已经构建成功NAR1基因缺失酵母菌株,并证明该酵母的复制寿命明显缩短,抗氧化损伤能力显著降低,但机理尚不明了。酿酒酵母中存在两种形式的超氧化物歧化酶(SOD):①MnSOD,它主要存在于线粒体基质,由SOD2基因编码;②CuZnSOD,它存在于胞质和线粒体内膜,由SOD1基因编码。SOD能消除细胞中产生的超氧阴离子和H2O2,是机体抵抗氧化损伤的重要手段。为探讨NAR1影响寿命和抗氧化损伤能力是否与SOD有关,本项目在NAR1基因缺失酵母菌株的基础上,进一步缺失或过表达SOD,检测酵母的复制寿命、抗氧化损伤能力及SOD的活性,以证实两者在功能上是否存在协同作用,进一步揭示NAR1基因发挥功能的分子机理。 方法: PCR扩增含有不同酶切位点的SOD1和SOD2基因片段,利用带有不同营养选择标记的pRS303、pRS305、 pRS306质粒,构建含有SOD的重组质粒,利用同源重组的方法将质粒转化进NAR1基因缺失菌株,使SOD在酵母中过表达;用强氧化剂百草枯对酵母进行处理,玻璃珠法提取活性酵母衍生物,BCA蛋白浓度检测试剂盒和总SOD活性检测试剂盒分别检测活性酵母衍生物中的蛋白含量和SOD酶活力,并用菌落形成实验观察酵母细胞抗氧化应激能力的变化;在标准的AXIO光学显微镜下,用纤维针对酵母出芽的子细胞进行分离并计数,测量酵母菌株的复制寿命。 结果: 在NAR1基因缺失菌株中成功实现了SOD1的缺失、SOD1和SOD2分别过表达以及SOD1和SOD2同时过表达的菌株构建;利用强氧化剂百草枯处理野生型和突变型菌株时,NAR1基因缺失突变株及单独过表达SOD1或SOD2的突变株抗氧应激能力均降低,SOD活性均有上升。复制寿命结果显示,野生型菌株的平均寿命为35.625代,NAR1基因缺失突变株复制性寿命缩短,为31.35代;SOD1或者SOD2单独过表达后的平均寿命分别为31.1代和30.55代,均未能使NAR1突变株的寿命得到恢复。SOD1和SOD2同时过表达后菌株的平均寿命为34.425代,使NAR1突变株的寿命得以恢复。 结论: NAR1基因在酵母的寿命机制和抗氧化应激中发挥着重要的作用,且通过同时过表达SOD1和SOD2能够使得NAR1基因缺失杂合菌株的寿命得以恢复正常,而单过表达SOD1或者SOD2未能使NAR1基因缺失杂合菌株的寿命恢复正常,在NAR1基因缺失杂合菌株中GSH1的mRNA水平降低。