研究一 Beagle犬骨髓间充质干细胞的体外分离、培养及鉴定目的:探讨Beagle犬骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外分离、培养条件以及生物学特性的相关鉴定。方法:Beagle犬使用戊巴比妥钠麻醉(30mg/Kg)成功后,浓度8%的硫化钠液脱毛、温清水擦拭、碘伏液消毒后铺无菌巾单,无菌操作下,选用16号骨髓穿刺针,分别自左右两侧髂嵴抽取Beagle犬骨髓血,注入含肝素和DMEM/F12的离心管内,采用全骨髓血联合贴壁法培养Beagle犬骨髓间充质干细胞:骨髓血以1500转/分,离心5分钟,弃上清,加入DMEM/F12适量。再以1200转/分,离心5分钟,弃上清液,计数,调整细胞密度为5×10-1mL,加入完全培养基中(培养基主要成分包括:DMEM\F12培养液(HYCLONE公司,USA)、10%的胎牛血清(HYCLONE公司,USA)、青链霉素混合液(Solarbio公司,pH=7.2),制成细胞悬液,吹打混匀后接种于25cm2培养瓶内,置于37℃,含5%C02培养箱中常规培养。48小时后首次给予全量换液,以后每48小时至72小时、培养基变黄时换液1次。当细胞融合至80%,采用0.25%胰蛋白酶常规消化,按1:2或1:3传代培养至第三代。形态学观察:倒置显微镜下观察BMSCs贴壁细胞形态、增殖生长速度及群体生长方式等特征。免疫荧光组织化学染色:取第3代BMSCs制备细胞爬片,行苏木精-伊红染色(HE染色)、行CD34,CD44,CD90抗体免疫荧光染色,应用免疫荧光化学染色法进行细胞鉴定,应用流式细胞仪检测干细胞表面标记物的表达,CCK-8检测细胞增殖,检测骨髓间充质干细胞的生长特性。结果:原代Beagle犬骨髓间充质干细胞培养至第4天,通过倒置显微镜观察见视野中有大量成纤维细胞样细胞,它们相互聚集形成细胞单位,在细胞培养瓶底部形成细胞克隆,这些克隆就是所谓的成纤维细胞样克隆。更换新的细胞培养液。从细胞培养的第7天开始,至第10天这段时间,细胞单位的数量在不断变多,面积在不断变大,形成直径为5至9mm的面积较大的克隆单位和<5mm的小克隆单位。免疫荧光染色结果:CD44阳性(+)、CD90阳性(+),而CD34(_),细胞核周围呈黄褐色;流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面CD34(-),而CD44与CD90阳性(+),CCK-8检测细胞增殖,细胞稳定增殖。结论:骨髓间充质干细胞是成纤维样细胞,具有成克隆性、生长活力旺盛、自我更新能力强等主要特征;在体外利用全骨髓联合贴壁法可成功实现Beagle犬骨髓间充质干细胞的扩充、增殖;骨髓间充质干细胞可以作为组织工程技术的种子细胞,为组织工程学方法在修复股骨头软骨缺损的应用中提供了实验基础。研究二 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架-骨髓间充质干细胞复合体的体外实验研究目的:中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料对骨髓间充质干细胞的生物相容性,以及细胞在支架材料上的贴附、生长及增殖情况。方法:体外以中药牡蛎壳和褐藻作为原料,将其提取物壳聚糖及海藻酸钠通过组织工程的方法,合成具有生物降解功能的支架材料,并将体外分离、培养的Beagle犬骨髓间充质干细胞种植在支架材料上。采用扫描电镜观察中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架上骨髓间充质干细胞的附着、生长和增殖情况。其目的在于探讨中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架与Beagle犬骨髓间充质干细胞的生物相容性。结果:通过扫描电镜(SEM)检测,显示中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架为三维多孔材料,孔隙率大约为75%。中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料与骨髓间充质干细胞复合,细胞具有良好的粘附和增殖、分化能力。细胞接种后2小时,观察到骨髓间充质干细胞生长状态良好,附着在壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料上并延伸、生长。接种后1天,观察到细胞呈扁平状,部分细胞生长进入或穿过相连的孔隙。随着培养时间的延长,壳聚糖/海藻酸钠三维孑L隙膜支架材料上的骨髓间充质干细胞数量逐渐增多。结论:中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料具有适合骨髓间充质干细胞增殖分化的三维多孔空间构造。将体外分离、培养的Beagle犬骨髓间充质干细胞种植在中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料上,体现出二者具有良好的生物相容性,可作为一种良好的软骨组织工程支架材料。研究三中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架-骨髓间充质干细胞复合体修复Beagle犬股骨头软骨缺损的动物实验研究目的:探讨中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料与骨髓间充质干细胞复合体植入Beagle犬股骨头软骨缺损区域,观察其在体内修复Beagle犬股骨头软骨缺损的效果,评价中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料与骨髓间充质干细胞复合体在治疗Beagle犬股骨头软骨缺损中的作用及价值。方法:36只6个月龄Beagle犬均采用外科手术方式建立 Beagle犬股骨头软骨缺损模型。根据不同移植物自由组合为3组,实验中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架-骨髓间充质干细胞组(A组):24只Beagle犬左侧股骨头非负重区软骨缺损区域填放中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料-骨髓间充质干细胞复合体。对照中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架组(B组):24只Beagle犬右侧股骨头非负重区软骨缺损区域放置空白中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料。空白组(C组):12只Beagle犬双侧股骨头非负重区软骨缺损处不做任何处理。分别于术后第8周和术后第12周对实验动物的生长状态行一般观察后处死实验动物,收集各组实验动物的股骨头标本,将标本作相应切片处理后行形态学观察、HE染色、甲苯胺蓝染色、免疫组化以及透射电镜检查。结果:术后8周,结果显示,中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架-骨髓间充质干细胞组关节面轻微不光滑,软骨缺损区域局部凹陷,软骨缺陷区域被大量类似于正常软骨组织的半透明组织填充,与周围正常软骨组织相延续;与中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架-骨髓间充质干细胞组相比较而言,中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架组关节面更加不光滑,软骨缺损区域明显凹陷,软骨缺陷区域被少量类似于正常软骨组织的半透明组织填充,与周围正常软骨组织不连续,软骨下骨明显暴露;空白组软骨缺损区域无明显关节软骨组织填充,软骨下骨组织被完全暴露。术后12周,中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架-骨髓间充质干细胞组关节面非常平滑,软骨缺陷区域被大量类似于正常软骨组织的半透明组织填充,与周围正常软骨组织相延续;与4周前相比较而言,中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架组关节面更加平滑,但是仍然存在明显的凹陷,软骨缺陷区域被更多量的类似于正常软骨组织的半透明组织填充,且与周围正常软骨组织相延续,软骨下骨组织被部分覆盖;空白组关节软骨缺损部位仍无关节软骨组织填充,软骨下骨组织仍明显暴露。结论:以中药提取物壳聚糖/海藻酸钠为膜支架,以骨髓间充质干细胞为种子细胞,在体外构建的复合体可有效促进Beagle犬股骨头软骨缺损的软骨组织修复。