论文部分内容阅读
PI3K作为细胞内非常重要的信号传递分子，参与细胞增殖、凋亡、转录、翻译、代谢以及周期调控等众多的生命过程。研究表明，I类PI3K的四个亚型与肿瘤的发生发展有着密切的关系，PI3K被确认为是充满前景的抗肿瘤靶点。其中PI3Kδ在B细胞来源的白血病中多表现为持续性的激活状态，抑制该靶点可有效地控制疾病进展。目前，许多研究院所和医药公司都纷纷致力于PI3K抑制剂的研究和开发，若干候选药物已经进入了临床Ⅰ/Ⅱ期临床研究，显示出良好的应用前景。目前我国尚未有该类候选药物进入临床研究，为研究和开发具有自主知识产权的抗肿瘤药物提供了机遇与挑战。本课题建立了一系列分子和细胞水平筛选PI3K抑制剂的模型，并对新发现的PI3K6抑制剂X-370进行了系统深入的抗肿瘤机制研究。 在分子水平上，我们利用昆虫细胞重组表达出PI3K蛋白，6×His和GST两次亲和标签纯化得到纯度理想的PI3Kα蛋白，之后利用检测ATP浓度的方法检测了PI3Kα的激酶活性，且PI103能够完全抑制其激酶活性。在此基础上开始建立分子水平的ELISA模型，首次采用biotin标记PIP2作为直接底物参与反应，利用Grp1-PH蛋白结构域特异性识别PIP3，最后通过TMB显色，读耳义OD值指示激酶活性。优化了反应缓冲液、激酶用量、底物和ATP浓度、反应时间、抗体浓度等条件后该方法得以完善，并检测PI103得到IC50=32.2nM。 在细胞水平上，我们建立了基于Akt磷酸化或PIP3水平的PI3K抑制剂筛选模型。Akt磷酸化水平是细胞内PI3K活性的重要指标，我们建立了检测磷酸化Akt的ELISA方法。在确定OD读值与Akt磷酸化浓度之间具有线性关系的基础上，证实了用Westernblot和ELISA方法检测Akt磷酸化水平的一致性。通过优化细胞密度、IGF-1和抗体浓度等条件测得PI103在细胞水平抑制Akt磷酸化的IC50为47nM。除了Akt磷酸化水平，PIP3是PI3K直接产物，检测它的改变能够更加直接地反应PI3K活性。利用Grp1-PH蛋白结构域对PIP3的特异性结合，将融合蛋白EGFP-Grp1-PH蛋白表达于Rh30细胞内，IGF1刺激激活P13K产生PIP3从而招募EGFP-Grp1-PH至细胞膜上，形态上表现为绿色荧光在细胞膜上成点状聚集，间接将PIP3可视化。PI3K抑制剂GDC0941可以逆转这个过程，表明这种方法可以用于PI3K抑制剂的筛选和鉴定。 与此同时，我们还在细胞水平上建立了检测PI3K亚型选择抑制剂的模型。在Rh30细胞内分别高表达持续活化的人I类四个PI3K的催化亚基，无血清饥饿的条件下，这些细胞内表现出亚型特异性PI3K活性。以Akt磷酸化水平为指标，只有相应亚型选择性抑制剂可以抑制这种活性，说明这组细胞可以用于抑制剂亚型选择性的鉴定。 利用以上建立的模型，我们筛选了近600个不同来源的小分子化合物，得到了数十个具有PI3K抑制活性的化合物。并对PI103进行了结构改造，初步探索了其构效关系，发现PI103衍生物结构9保留与之相当的PI3K选择性抑制活性，结构9的部分烷烃酯衍生物具有比PI103更强的细胞增殖抑制活性，对PI3K信号通路的抑制也更高效。 我们通过理性设计和筛选得到了一个对PI3Kδ具有高选择性的抑制剂X-370。其对PI3Kα/PI3Kβ/PI3Kγ/PI3Kδ的IC50分别是433nM/>1000nM/>1000nM/7nM，10μM浓度时对人类Ⅱ、Ⅲ类PI3K以及代表性61个其它蛋白激酶无明显抑制。X-370能够强效(<5nM)地抑制由细胞因子M-CSF激活的PI3K6，但对由IGF-1、LPA或MCP-1分别激活的P13Kα、P13Kβ或P13Kγ无明显抑制效果(>500nM)。同样的，X-370在较低浓度下就能明显下调Rh30-Myr-p1108细胞内Akt磷酸化水平，而对Rh30-Myr-p110α/β/γ细胞内的Akt磷酸化的抑制则需要更高浓度。X-370对Rh30-Myr-p110α/β/γ/δ细胞的EC50分别为680nM/400nM/460nM/32nM(AktpT308为指标)和530nM/290nM/230nM/20nM(AktpS473为指标)，进一步在细胞水平证实了X-370对PI3Kδ的选择性抑制。X-370浓度依赖地抑制Raji和SU-DHL-6细胞内PI3K信号通路代表性分子如Akt、GSK-3β、p70S6k1的磷酸化，并且Erk磷酸化水平也随之降低。X-370在浓度为0.5μM时持续抑制Akt和GSK-3β的磷酸化达72h，但p70S6k1和Erk的磷酸化在作用48h时开始恢复。Raf、Akt或mTOR抑制剂对Erk磷酸化没有影响，但PDK1和MEK抑制剂可以下调Erk磷酸化水平，确定X-370通过PI3K/PDK1/MEK信号转导下调Erk磷酸化。在X-370处理Raji细胞后，用PDK1抗体免疫共沉淀的MEK量减少，进一步证实X-370通过抑制PI3K8进而抑制PDK1和MEK的结合从而引起MEK磷酸化下降，达到抑制Erk磷酸化的目的。X-370可以剂量依赖地诱导Raji细胞发生G1期阻滞，并且随着作用时间的延长，细胞内Caspase3/7活性明显升高，细胞出现凋亡。X-370对大部分(8/13)人原代急性B淋巴型白血病细胞的活力具有显著的抑制效果(IC50<1μM)，这些细胞内Erk磷酸化在X-370处理后明显下降，但对X-370耐受(IC50>10μM)的细胞样本无此现象，提示Erk磷酸化受PI3Kδ调控的急性B淋巴型白血病细胞可能对X-370敏感。 综上所述，我们建立了分子水平和细胞水平的系列PI3K抑制剂筛选模型，综合运用这些模型筛选得到了数十个具有PI3K抑制活性的化合物，并初步探索了PI103系列衍生物的构效关系，同时对PI3Kδ选择性抑制剂X-370做了系统的体外抗肿瘤活性和作用机制研究。以上模型将会为PI3K抑制剂的开发提供平台基础；活性化合物为进一步结构优化以发现具有开发前景的候选药物提供了线索；PI3K8抑制剂X-370显著抑制人急性B细胞型白血病细胞增殖的研究不仅进一步揭示了P13Kδ抑制剂新的作用机制，丰富了PI3Kδ介导信号通路内涵，而且为该类药物的合理用药提供了理论依据。