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目的:本文建立高效液相色谱–串联质谱(HPLC–MS/MS)法测定生物样品中吗啡-6-葡萄糖醛酸(morphine-6-glucuronic acid,M6G)的药物浓度,旨在研究M6G注射液在体内的吸收、分布、代谢和排泄,为其进一步研究与开发提供科学依据。方法:(1)大鼠血浆样品中的待测物M6G和内标YN-7507经固相萃取板萃取处理后,采用Atlantis d C18(2.1×150 mm,5μm)色谱柱分离,通过电喷雾电离源(electrospray lonization,ESI)以多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)方式进行正离子检测。用于定量分析的离子对分别为m/z:462.2→286.1(M6G)和478.11→268.2(YN-7507)。(2)选用Sprague-Dawley大鼠24只,雌雄各半,分为3个剂量组,每组4只动物/性别,各组给药剂量分别为2、4、6 mg/kg(以M6G二水物计),给药容量均为4 m L/kg,10-20 s完成给药。动物于药前,给药结束后2 min、5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h的时间点采集血样。实验采用HPLC-MS/MS方法分析大鼠血浆中M6G的浓度,方法的定量下限为5 ng/m L。用代谢动力学数据分析软件Win Nonlin 6.2的非房室模型法(non-compartment model,NCA)对血浆浓度数据进行分析,计算药代参数,考察给药后M6G在动物体内的代谢特征。(3)选用Sprague-Dawley大鼠30只,雌雄各半,按性别区段随机分为5组,另设空白组5只/性别。动物按照4 mg/kg的剂量静脉注射给予M6G注射液,其中分布组动物分别在给药后0.5 h、2 h和4 h安乐死,每个时间点3只/性别,采集血浆、脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、体脂、肌肉、生殖腺(雄性:睾丸;雌性:卵巢);胆汁组及部分空白组替换动物分别在给药后0.5 h、2 h、4 h、8 h收集胆汁;粪尿组动物分别在给药后4 h、8 h、24 h、48 h、72 h收集尿液和粪便,每个时间段3只/性别。采用HPLC-MS/MS方法检测血浆样品中M6G的浓度,同时参考该方法对各组织、胆汁及粪尿中M6G的检测方法进行部分验证,并对上述生物基质中M6G的浓度进行测定。结果:(1)本方法M6G的线性范围为5-1000 ng/m L,标准曲线样品各点的准确度在92.36%-104.18%之间,其线性系数均大于0.99。质控样品(15、120、800 ng/m L)的平均准确度在98.76%-103.40%之间,除超限样品外,其余质控样品的准确度在87.32%-111.60%之间。质控样品的批内精密度在3.90%-9.63%之间,批间精密度在4.04%-8.79%之间。M6G分析方法的定量下限为5 ng/m L。定量下限样品的平均准确度在101.50%-109.60%之间,除超限样品外,其余定量下限样品的准确度在87.00%-119.40%之间。定量下限样品的批内精密度在8.33%-11.15%之间,批间精密度为10.09%。M6G的低、中、高浓度样品的提取回收率在87.51%-118.27%之间,其CV(变异系数)值在6.98%-8.35%之间,基质效应在88.96%-115.82%之间,其CV值在4.91%-9.54%之间。M6G的稀释回收率(100倍)在101.08%-108.09%之间,CV是2.35%。(2)按照2、4、6 mg/kg(以M6G二水物计)的给药剂量,单次静脉推注给予大鼠浓度分别为0.5、1、1.5 mg/m L的M6G注射液后,M6G的t1/2分别为0.41、0.40、0.39 h,Cmax分别为7417.16、15496.22、21920.37 ng/m L,AUC(0-8h)分别为2020.0、3832.8、5513.9 h·ng/m L,AUCinf分别为2022.7、3839.1、5523.4 h·ng/m L,Vd分别为573.87、612.39、608.56 m L/kg,Cl分别为999.78、1069.31、1112.92 m L/h/kg,MRT分别为0.26、0.26、0.25 h。M6G注射液以2、4、6 mg/kg(以M6G二水物计)的剂量静脉推注给药,雌性与雄性M6G的平均Cmax比率分别为1.03、0.97、1.16,平均AUC(0-8h)的比率分别为0.95、0.81、1.04。M6G注射液在2-6 mg/kg(以M6G二水物计)的剂量范围内静脉推注给药,动物血浆中M6G的峰浓度及AUC随剂量增加而增大。3个剂量组的剂量比率为1:2:3,雄性动物M6G的平均Cmax比率为1:2.15:2.77,平均AUC(0-8h)比率为1:2.05:2.62;雌性动物M6G的平均Cmax比率为1:2.03:3.13,平均AUC(0-8h)比率为1:1.74:2.85;动物总体M6G的平均Cmax比率为1:2.09:2.96,平均AUC(0-8h)比率为1:1.90:2.73。(3)动物按照4 mg/kg的剂量静脉注射给予M6G注射液后0.5 h,M6G在各组织中均有分布,在小肠中相对浓度最高,其次为肾、胃和肝,在脑中的浓度相对最低,各组织脏器中M6G浓度依次为小肠>肾>胃>肝>肺>生殖腺>肌肉>体脂>脾>心>脑;给药后2 h,M6G在血浆和各组织中的浓度迅速下降,但在脑组织中浓度下降较慢,相对于给药后0.5 h,M6G消除不到一半;给药后4 h,除胃、小肠外,其他组织和血浆中M6G浓度均接近或低于定量下限。给药后8 h胆汁中M6G原型的平均累积排泄率为27.70%,剔除死亡动物,给药后8 h M6G原型累积排泄率为42.77%。给药后72 h尿中M6G原型的平均累积排泄率为23.90%,粪中为0.04%。检测大鼠各组织、胆汁、尿液和粪便中M6G的HPLC-MS/MS方法的部分验证结果显示,该方法满足生物分析的要求,适用于本实验中各生物基质样品中M6G的测定。结论:建立了HPLC–MS/MS法测定生物样品中M6G的含量,该方法灵敏、简便、重现性好,适用于生物样品中M6G浓度检测及药代动力学研究。大鼠在静脉注射给予M6G注射液后,M6G分布广泛,各组织中均可检测到M6G,其中在小肠、肾、胃和肝中浓度相对较高,在脑中的浓度相对较低,M6G在各组织中的浓度消除较快,且随血药浓度下降而下降,但在脑组织中下降较少,给药后0.5-4 h脑组织中M6G的消除相对较慢。很少量的M6G原型经粪便排泄,部分M6G原型经胆汁及尿排泄。