论文部分内容阅读
本文建立了适合于油气田土壤样品的DNA提取方法、丙烷氧化菌的定量PCR技术和丙烷氧化菌的平板培养技术，并将其应用于油气田土壤中丙烷氧化菌的定量检测，对两种方法的结果进行比较和分析得到主要的研究结果如下：（1）利用优化的平板培养技术对采集的油气田土壤进行培养。结果表明，采集的土壤样品中丙烷氧化菌数量范围为104~106CFU/g干土；丙烷氧化菌数量随土壤深度从30cm到60cm无明显的差异。不同采样区域的培养结果发现，背景区样品的丙烷氧化菌含量为1.0×10~5~5.0×10~5CFU/g干土。油田区和气田区样品与背景区相比出现了丙烷氧化菌数量的相对高值，尤其是油田区样品，以Y1-6，Y2-1，Y2-2，Y3-5和Y3-6样品为例，其丙烷氧化细菌数量均达到了106CFU/g干土，高出其它样品0.5~1.5个数量级。同样达到106（CFU/g干土）数量级的点位还有气区的Q7-2和Q8-1，但背景区没有达到106（CFU/g干土）数量级的点位。（2）利用物理法、化学法和酶法相结合的裂解方法破碎油气田土壤中微生物细胞，有助于提高细胞裂解效率，进而提高土壤的DNA提取得率。比较不同裂解方法的DNA提取的效果可知，液氮研磨方法裂解细胞效果最佳，反复冻融法其次，但该方法更适合于野外样品DNA的实时提取。该论文中优化的DNA手工提取方法与商用试剂盒相比，单个样品提取成本降低约80%。利用T-RFLP技术分析粗提DNA样品经商用纯化柱纯化后的基因多样性差异，其结果表明纯化后的DNA样品与纯化前相比微生物多样性反而提高。这表明粗提DNA溶液中蛋白质、腐植酸等杂质的去除能提高土壤DNA的PCR扩增效率，因此进一步纯化粗提DNA溶液对手工提取土壤DNA是有必要的。（3）建立了基于丙烷氧化菌prmA基因的定量PCR检测技术，并对采集的油气田土壤样品进行prmA基因定量检测。结果表明，检测样品的丙烷氧化菌prmA基因拷贝数为104~106拷贝数/g干土。不同采样区域的培养结果发现，背景区样品的丙烷氧化菌基因丰度含量为1.0×103~5.0×104拷贝数/g干土。油田区和气田区样品与背景区相比出现了丙烷氧化菌基因丰度的相对高值，尤其是油田区样品，以Y2-2，Y2-3和Y2-4样品为例，其丙烷氧化细菌数量均达到了10~5拷贝数/g干土，高出其它样品0.5~2个数量级。同样达到10~5数量级的点位还有气田区的Q5-2，背景区没有达到10~5（copies/g干土）数量级的点位。（4）传统的平板培养方法与新型的定量PCR技术应用于油气田土壤中丙烷氧化菌的定量检测得到了相似的研究结果，即油田区和气田区的部分样品中丙烷氧化细菌数量与背景区样品相比出现了异常高值。由于出现异常高值的点位较少，且高值差异仅0.5~1个数量级，因此基于丙烷氧化菌的油气指示菌定量检测技术的大规模应用仍需进一步的试验和验证，以期为指导油气微生物勘探的实践提供有力手段。