癫痫是一种多因素、多病因相关的复杂慢性疾病症候群,主要表现为大脑皮层神经元异常超同步化放电导致中枢神经系统短暂功能障碍,也是目前危害极大的常见神经疾病之一。经一线抗癫痫药物治疗后,大多数患者可达到临床缓解或控制的效果,但仍有约30%左右的癫痫患者会转变为药物难治性癫痫（Drug-Resistant Epilepsy,DRE）,表现为较差的预后。DRE无可控的药物,但可以通过系统的术前评估,找到确切痫灶,绝大部分患者能从手术获益,其核心是致痫灶定位,成为手术治疗最为关键的因素。颅内电极脑电图（intracranial electroencephalography,iEEG）是癫痫致痫灶评估的重要手段,尤其是对经过头皮EEG及其它无创性评估手段仍不能确切定位的癫痫患者^[1]。以FCD等微小结构病变或MRI阴性患者受益更多。颅内电极可分为硬膜外电极、硬膜下皮层电极（包括条状和栅状电极）和深部电极,但他们的安全性、出血率及定位情况鲜有系统的研究和报道,这涉及到致痫灶的定位、切除范围及获得痫灶核心切除标本更准确的病理结果,对临床疗效及科学研究均起到至关重要的作用,对阐明难治性癫痫发生的病理及相关分子机制研究也起到积极的推动作用。临床研究显示,皮质发育障碍（Malformations of Cortical Dysplasia,MCD）是难治性癫痫最重要病因,占难治性癫痫手术治疗的37.6%⁵7.6%,在成人难治性癫痫病因中排第二或第三位,而在小于3岁的儿童难治性癫痫中MCD更高达80%,排名首位。MCD亚型较多,其中局部皮质发育障碍（Focal Cortical Dysplasia,FCD）是MCD最典型、最常见的临床亚型,其结构表现为同质异构的皮质病灶群,其导致的癫痫表型通常为药物难治,即耐药性癫痫。因MCD致痫机制复杂,涉及因素众多,MCD致痫机制假说众多,如谷氨酸受体假说、GABA受体假说、GABA突触活动起搏器假说、mTOR通路过度活性假说、成熟障碍假说、炎症、免疫致痫机制假说及表观遗传学致痫假说等,但具体机制不清,确切证据不足。因此,有效阐明FCD的病理发生及相关癫痫发生的分子学机制,对难治性癫痫的诊断与治疗具有重要的临床意义。精准医学的异军突起,使得从遗传学角度寻找MCD候选致病基因,成为当前临床研究的热点与关注焦点。目前报道癫痫相关致病基因研究主要从MCD入手,至今已发现超过100余种基因突变与MCD相关,由于MCD类型复杂且病例数量限制,进展不理想,FCD候选致病基因探索不多。目前,除已明确TSC1或TSC2基因是MCD亚型-结节性硬化症（Tuberous Sclerosis Complex,TSC）的候选致病基因外,其他类型FCD尚未找到确切相关候选突变基因。因此,深入探索FCD相关候选致病基因,并进一步探索下游基因功能与癫痫表型的关系,不仅有助于了解FCD相关致病基因功能,而且还有助于明晰临床对FCD病理发生及致痫机制的理解与认识。全外显子测序（Whole exome sequencing,WES）是基于下一代测序（Next-generation sequencing,NGS）的新兴高通量测序技术之一,通过基因组外显子区域特异性捕获方法,可最大程度及深度覆盖靶基因编码区。WES较昂贵的全基因组测序（Whole genome sequencing,WGS）不仅具有较高的性价比,还可精确快速检测新生（de novo）突变。目前,WES已广泛应用于多种复杂神经系统疾病检测,且能够较准确鉴别分析罕见单基因癫痫以及儿童发育性癫痫性脑病的新基因。因此,本课题拟分四部分进行。首先,本研究从FCD等相关难治性癫痫术前EEG评估入手,对比两种电极定位痫灶的方法,为获得更佳的术后疗效及更典型的病理标本奠定基础。其次通过手术切除标本,选取MCD最典型的FCDII病理类型,通过WES技术对FCD II相关药物DRE样本进行检测,结合生物信息学分析与文献回顾,初步筛选出FCD潜在的相关候选基因;第三,通过扩大检测样本量,对初筛选定的FCD候选基因进一步大样本WES验证,分析该候选基因在正常样本、FCD和其他病因组的突变率,明确其与临床手术预后的关系;第四,通过建立海人酸（KA）诱导急性癫痫小鼠动物模型,明确急性癫痫发作状态下小鼠脑皮质组织中该候选基因表达水平以及组织细胞定位关系;最后选取候选基因敲除小鼠结合KA诱导方法,进一步分析该基因缺失对KA诱导癫痫发作的潜在影响。相关结果如下:一、FCD等DRE患者EEG术前评估初探该部分研究入组包含FCD病例等DRE患者100例（SEEG 48例,subdural EEG 52例）,并进行痫灶定位及术后并发症比较分析。结果显示,两组定位率与硬膜下皮层电极比较,SEEG具有更少的并发症,尤其是出血和感染。SEEG技术已取得明显进展,在癫痫致痫灶评估上有更好的应用前景。二、基于WES技术分析FCDII相关癫痫基因突变1.选取18例FCDII型（FCD IIa 9例+FCD IIb 9例）进行WES检测与生物信息学分析,结果发现FCD IIa及FCD IIb两组独立或共交集62个位点I-III级突变,突变主要涉及mTOR通道及发育、炎症与肿瘤及代谢类;2.通过SNP质谱分型技术,我们从3例FCD II患者（2例FCD IIa与1例FCD IIb）的外周血及脑标本筛查出SCARB1、PMS1及LTBP1基因有可疑致病突变位点;通过一代Sanger测序验证,在2例FCD IIa一代直系亲属发现了与先证者相同的杂合突变,另外1例母亲野生型（父亲已故,无从查证）,SCARB1 c.1401G>A、PMS1c.A55T>A及LTBP1 c.A3248G>A为可疑致病突变,其突变意义不明;3.通过文献回顾分析,我们发现SCARB1基因参与体内胆固醇转运与代谢,并与阿尔茨海默病、癫痫等许多中枢神经系统疾病密切相关,提示SCARB1很可能参与FCD type II相关癫痫疾病发生发展过程。因此,我们将聚焦SCARB1基因进行进一步样本验证与功能分析。三、FCD等病因相关难治性癫痫扩大样本（WES）分析,聚焦SCARB1基因;基于前部分基础,本部分将继续扩大DRE样本量进行WES验证,并按病因分成FCD组（n=26）、TSC组（n=8）、MRI阴性组（n=27）及脑软化/萎缩/肿瘤等后天获得性病因组（n=14）,以正常组为对照（数据库分析）,聚焦SCARB1基因,分析当前已知致病基因突变情况及未知基因SCARB1基因突变率,并初步明确DRE患者外科干预预后与基因突变的关系,结果发现:1.76例DRE样本中,检出35例（46%）非SCARB1其他基因致病突变;未检出致病突变41例（54%）,其中各病因组的阳性致病突变率分别为TSC 100%（8/8）,MRI阴性组55.6%（15/27）,FCD组30.7%（8/26）,脑软化/萎缩/肿瘤等后天获得性病因组7.1%（1/14）,提示除TSC外,MRI阴性及FCD相关DRE亦有较高的基因突变;2.76例DRE样本中,共7例患者检测出移码突变、剪切点变异及非同义突变等SCARB1基因I-III级变异,其中5例在FCD组（71.4%）,2例在MRI阴性的DRE（28.6%）,TSC组、脑软化/萎缩/肿瘤等后天获得性病因组等其他组未见突变;提示,SCARB1突变与难治性癫痫可能相关,尤其和FCD相关DRE密切;3.200例正常对照样本SCARB1突变III级变异率为8.5%（17/200）,无I级与II级变异（0）;76例DRE样本SCARB1突变III级变异率为9.2%（7/76）,II级变异率为1.3%（1/76）、无I级变异（0）;26例FCD样本SCARB1突变III级变异率为19.2%（5/26）,II级为3.85%（1/26）,无I级变异（0）。统计分析表明:SCARB1基因III级突变率各组间无显著差异（P>0.05）;SCARB1 II级突变,DRE与正常组间无显著差异;DRE无致病突变组与正常对照组间差异显著（P<0.05）;FCD组与正常对照组间差异显著（P<0.01）,进一步提示SCARB1基因突变与FCD相关DRE密切相关;4.DRE患者手术预后与基因突变关系分析发现,共29例DRE接受手术治疗患者,术后有效率（Engel’s I-III级）为96.6%,优良率（Engel’s I-II级）79.3%。FCD合并致病基因突变组和FCD无致病基因突变组,获得I级分别是50%（3/6）和62%（8/13）,两组之间无统计学差异（P>0.05）,FCD合并SCARB1阳性突变的3例术后患者均无I级疗效获得者,两组之间有统计学差异（P<0.05）;5.在筛除掉SCN1A,KCNQ2等离子通道等手术负性因子,FCD伴有的NMDA受体相关类GRIN2A及T型钙通道相关的CACNA1H突变仍然可作为优秀手术治疗候选者,但SCARB1除外;以上结果表明SCARB1突变与DRE相关,尤其与FCD相关DRE关系密切。但在癫痫发生作用如何,需采用动物模型研究进一步证实。四、基于癫痫动物模型探讨SCARB1基因与癫痫发生的关系本部分研究基于急性癫痫诱导小鼠模型,深入探讨SCARB1基因与癫痫发生的关系。首先,通过建立急性癫痫诱导小鼠模型,分析急性癫痫发作状态下小鼠脑皮质组织SCARB1基因表达与组织细胞定位;其次,利用SCARB1^-/-基因敲除小鼠结合癫痫诱导技术,初步分析SCARB1缺失对KA诱导癫痫发作的潜在影响与作用。结果发现:1.采用海人酸（KA）诱导方法建立急性癫痫诱导小鼠模型;Western Blot检测发现急性癫痫发作状态下,小鼠脑皮质组织中SCARB1蛋白表达明显上调;免疫组织化学与免疫荧光结果显示,SCARB1蛋白主要高表达于脑皮质组织神经元细胞膜表面;2.本部分采用SCARB1^-/-基因敲除小鼠结合KA诱导急性癫痫发作方法,我们发现SCARB1敲除明显缩短KA诱导癫痫发作的潜伏期,显著延长发作及放电的持续时间,表明SCARB1敲除能明显增加癫痫神经元兴奋性,进而增强KA诱导小鼠急性癫痫发作,进一步提示SCARB1可能对癫痫发作起保护作用。综上所述,本研究结果表明:1.经FCD等DRE病因EEG术前评估发现,SEEG和subdural EEG各具优势,但SEEG具有更少的出血和感染风险,有更好的应用前景。2.在FCD患者病灶中,存在大量潜在致病基因突变,主要涉及mTOR通道及发育、炎症与肿瘤及代谢等类型,其中SCARB1、LTBP1及PMS1等基因突变可能参与到FCD相关DRE病理形成与痫样发作。结合文献关于SCARB1基因参与体内胆固醇转运与代谢,并与阿尔茨海默病、癫痫等许多神经系统疾病密切相关的分析,推测SCARB1很可能是FCD相关癫痫发生发展的候选致病基因之一;3.聚焦SCARB1基因,在多病因相关的较大样本DRE尤其是FCD病灶组中,检测出较高的SCARB1基因移码、剪切点变异及非同义突变等I-III级变异,且FCD合并SCARB1阳性突变患者外科术后预后不佳,以上研究提示SCARB1突变涉及神经系统代谢及癫痫发生重要过程,可能是FCD相关DRE病理发生的一种重要候选致病基因;4.动物模型研究发现,SCARB1在KA诱导癫痫小鼠皮质组织高表达,且主要定位于神经元细胞膜表面。SCARB1敲除可明显缩短KA诱导发作的潜伏期,显著延长发作及放电的持续时间,进而增加癫痫小鼠神经元兴奋性,提高癫痫发作敏感性。此结果显示SCARB1可能具有抗癫痫作用,为癫痫治疗提供了新靶点;综合以上结果,我们推断:SCARB1基因突变使致SCARB1功能失活,导致癫痫患者的神经元兴奋性增加,进而提高癫痫发作的敏感性;同时提示,作为一个FCD相关癫痫候选致病基因,SCARB1在FCD疾病的病理形成及癫痫发作起到重要的作用,并可能作为FCD相关癫痫治疗的潜在靶点。