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在转基因植物的育种、生长发育、传代过程中,其外源基因、整合位点、整合拷贝数可能发生丢失、易位、变异等现象,从而导致外源基因本身表达性状发生改变。同时,还可能导致受体植物基因组内源基因表达性状的改变。这些改变为转基因植物的非预期效应。非预期效应一直是人们质疑转基因植物生物及食用安全性问题的焦点,也是研究转基因植物安全性检验和评价的热点和难点。本研究以转基因水稻科丰6号及其受体明恢86为材料,利用现有的技术条件,探索建立一套高效、灵敏、准确的检测鉴定外源基因的整合种类、整合位点、整合拷贝数的方法。获得主要的研究结果有:
1.利用植物基因组提取试剂盒及CTAB试剂法提取水稻基因组DNA,经比较分析:试剂盒在DNA样品纯化方面效果较好,用时较短但费用相对较高;CTAB法在提取大量植物基因组DNA时,易获得较高产量的基因组DNA,但易存在RNA碎片段、蛋白等残留,氯仿等试剂也存在较大的环境污染,提取时间也相对较长。
2.利用普通PCR及实时荧光定性PCR技术定向检测鉴定外源基因Cry1Ac、SCK、NOS、35S等种类。普通PCR和实时荧光定性PCR技术均能达到定向检测鉴定外源基因种类的要求。实时荧光PCR技术较普通PCR技术灵敏、高效和特异性好。二者检测结果都受到检测基因本身结构特点、引物(探针)设计及反应体系等多种因素的影响,需针对不同样品、不同基因进行方法的选择与设计操作。
3.利用TAIL PCR技术对外源基因整合位点的边界序列进行鉴定,通过TAILPCR技术三次延伸反应获得T—DNA整合边界序列。结果表明TAIL PCR方法能够鉴定转基植物中具有完整RB序列的T—DNA整合边界序列,也能用于检测转基因样品整合位点是否发生变异。
4.利用Taqman探针实时荧光定量PCR技术与Southern blot技术检测转基因水稻科丰6号外源基因Cry1Ac的整合拷贝数为单拷贝。结果表明实时荧光PCR方法检测样品需要量少,特异性好、灵敏度高,但结果需通过大量数据计算,所得结果只是真实拷贝数的近似值。运用Southern blot技术以DIG—探针进行免疫显色法检测,检测结果直观、稳定性好。但是检测过程需要大量的基因组DNA,整个样品的检测用时较长、工作量较大。