论文部分内容阅读
本实验使用基因克隆、Q-PCR和双荧光素酶报告系统等实验技术和方法对miR-378的种子序列突变以及突变后对miR-378功能的影响进行了相关研究,获得了以下结果：1、利用连聚合酶反应(PCR)技术扩增荣昌猪、内江猪,长白猪以及杜洛克的miR-378-2基因的DNA片段,将此片段进行测序,分析发现：荣昌猪和内江猪的miR-378-2基因中存在一个碱基A/G突变,长白猪和杜洛克猪中并没有发现此突变。此突变位于miR-378-2成熟体的种子序列,且突变能够改变pre-miR-378的二级结构及自由能。2、利用Q-PCR技术以及携带该突变个体的miRNA高通量测序数据对miR-378表达量进行分析发现,成熟体miR-378(野生型和突变型)主要分布于心肌、骨骼肌以及皮下脂肪等组织中,说明,miR-378分布具有组织特异性。3、通过构建野生型和突变型miR-378串联表达载体,在3T3-L1细胞中进行体外过表达。发现,miR-378突变后的表达量极显著高于突变前的表达量,说明,miR-378-2种子序列中A/G突变极显著增加了miR-378-2的表达量。4、基于种子序列与3’UTR区的序列匹配关系,以人的基因组为参考,对野生型miR-378和突变型miR-378的靶基因进行预测,结果显示,该突变完全改变了miR-378对靶基因的识别,突变型miR-378的靶基因的数量高于野生型miR-378的靶基因数量;对两种软件预测共有的靶基因进行交集和GO分析,结果显示,野生型和突变型miR-378具有完全不同的两种功能趋势,野生型miR-378功能主要与RNA相关的生命过程相关,部分与脂肪沉积相关;突变型miR-378功能主要与蛋白的降解有关,无与脂肪沉积相关的靶基因。5、随机挑选部分靶基因,利用双荧光素酶报告基因实验验证突变miR-378对抑制靶基因表达功能的结果表明,miR-378突变后出现失去对部分靶基因的识别能力(Loss-of-function)和获得一些新的靶基因(Gain-of-function)两个方面的改变。本研究在细胞水平证明了,种子序列的突变改变了miR-378的表达量和功能,可能影响miR-378参与的生物学过程,为后续研究miR-378种子序列突变后的功能奠定了基础,同时也为miRNA、突变功能验证提供了新思路。