背景与目的肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我国最常见的、也是发病率和死亡率最高的消化道恶性肿瘤之一,严重威胁人们的健康。因此,探索肝癌细胞生物学行为的发生机制,为HCC寻求有效的治疗途径十分必要。大多数癌细胞内存在着相对低氧的微环境。低氧诱导因子-2α(Hypoxia-inducible factor-2α,HIF-2α)是细胞氧信号途径中的关键转录调节因子,与恶性肿瘤的转归及预后密切相关。HIF-2α在肾癌、肝癌等肿瘤中高表达,它能通过启动其下游靶基因,而导致肿瘤细胞增殖、转移及侵袭力增强,加速疾病恶化。课题组前期研究发现,低氧环境下HIF-2α通过促进脂质分化相关蛋白表达,导致人正常肝细胞株LO2细胞发生脂肪变性。然而,有关HIF-2α能否通过调控肝癌细胞脂质代谢进而影响肝癌细胞生物学行为的研究,目前尚无报道。癌细胞的低氧环境加剧细胞内脂质合成。硬脂酰辅酶A去和酶1(Stearoyl-Co A desaturase-1,SCD1)是催化多元不饱和脂肪酸(Monounsaturated fatty acid,MUFA)合成的关键酶。课题组前期研究发现,SCD1在肝癌中高表达,它可通过抑制腺苷酸活化蛋白激酶(amp-activatedproteinkinase,ampk)负性调节肝癌细胞自噬以及细胞凋亡、促生存,而影响肝癌的形成及发展。但是,scd1在肝癌细胞中表达升高的机制尚不清,低氧环境下是否通过hif-2α介导其表达,未见相关研究报道。鉴于此,本研究首先观察低氧环境下hepg2、smmc-7721肝癌细胞株hif-2ɑ、scd1表达水平;在此基础上,使用hif-2α下调质粒及scd1小分子抑制剂cay10566,探讨hif-2α是否通过调控scd1表达,而影响肝癌细胞生物学行为,为hcc的发病机制提供新证据和潜在治疗靶点。方法:一、低氧诱导下肝癌细胞hif-2α和scd1之间的调控关系:1.细胞培养:用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的rpmi1640培养液和dmem培养液分别培养smmc-7721和hepg2细胞。2.低氧诱导肝癌细胞hif-2α和scd1蛋白表达时间谱:1%o2刺激hepg2和smmc-7721细胞0、3、6、12、24h,收集各时间点细胞并提取总蛋白,用westernblot(wb)法检测各时间点肝癌细胞hif-2α及scd1蛋白表达水平。3.筛选shrna-hif-2α质粒:设置空白、阴性质粒、shrna-hif-2αa-d质粒,按照shrna-hif-2α质粒的使用说明,在质粒转染72h后,用倒置荧光显微镜观察细胞内绿色荧光强度,用wb检测hif-2α蛋白表达水平,以筛选抑制效果最佳的shrna-hif-2α质粒。4.低氧下肝癌细胞hif-2α和scd1的调控关系:根据上述实验结果,选取12h为smmc-7721和hepg2细胞的最佳低氧诱导时间点;参照前期研究,用10μmscd1小分子抑制剂cay10566处理肝癌细胞24h[1]。分为以下几组:空白组(无任何处理)、低氧组(1%o212h)、低氧阴性对照组(hif-2α阴性质粒+1%o212h)、低氧干扰组(hif-2α干扰质粒+1%o212h)、低氧cay组(cay1056610μm+1%o212h)、低氧干扰+cay组(hif-2α干扰质粒+cay1056610μm+1%o212h),wb检测各组肝癌细胞hif-2α及scd1蛋白表达变化。二、低氧下hif-2α—scd1通路对hepg2和smmc-7721细胞生物学行为的影响:cck8技术检测各组细胞增殖情况,流式细胞术annexin-v/pe法检测各组细胞凋亡情况,侵袭小室实验检测各组细胞侵袭能力。结果:一、低氧诱导下肝癌细胞细胞hif-2α和scd1之间的调控关系1、低氧诱导肝癌细胞hif-2α和scd1蛋白表达时间谱:随着低氧诱导时间延长(0h、3h、6h、12h、24h),hepg2和smmc-7721细胞hif-2α和scd1蛋白表达均呈时间依赖性增加(p<0.05)。其中,smmc-7721细胞于低氧刺激12h时,hif-2α蛋白表达水平升高至平台期。因此,后续实验以12h为smmc-7721和hepg2细胞的最佳低氧诱导时间点。2、筛选shrna-hif-2α质粒:在质粒转染肝癌细胞72h后,各质粒转染率达90%左右;wb结果显示,与空白对比,shrna-hif-2αc质粒抑制肝癌细胞hif-2α蛋白表达的效果最佳(p<0.05)。3、低氧下肝癌细胞hif-2α和scd1之间的调控关系:wb结果显示,低氧环境下抑制hif-2α表达后,两种肝癌细胞表达scd1蛋白水平均明显降低(p<0.05);而抑制scd1表达,对肝癌细胞hif-2α蛋白表达无明显影响(p>0.05);同时抑制hif-2α和scd1表达,肝癌细胞表达scd1蛋白减少程度较单独抑制hif-2α或scd1的更为明显(p<0.05)。提示低氧条件下hif-2α对肝癌细胞scd1的表达具有一定调控作用。二、低氧下hif-2α—scd1通路对hepg2和smmc-7721细胞生物学行为的影响1、cck8检测肝癌细胞增殖情况:与空白组比较,低氧组、低氧阴性组hepg2和smmc-7721细胞增殖率升高(p<0.05);低氧环境下抑制hif-2α或scd1表达,hepg2、smmc-7721细胞增殖率较低氧组明显降低(p<0.05);同时抑制hif-2α和scd1表达,两种肝癌细胞增殖率较低氧组、低氧干扰组及低氧cay组均明显减少(p<0.05)。低氧组与低氧阴性对照组差异不具显著性(p>0.05)。2、流式细胞术annexin-v/pe法检测肝癌细胞凋亡改变:与空白组比较,hepg2、smmc-7721细胞低氧组及低氧阴性对照细胞凋亡率减少;低氧环境下抑制hif-2α或scd1表达,hepg2、smmc-7721细胞凋亡率较低氧组和低氧阴性对照组明显升高(p<0.05);同时抑制hif-2α和scd1表达,两种肝癌细胞凋亡率较低氧组、低氧干扰组及低氧cay组均明显增多(p<0.05)。低氧组与低氧阴性对照组差异不具显著性(P>0.05)。3、Transwell检测肝癌细胞侵袭改变:与空白组比较,低氧组和低氧阴性对照组HepG2和SMMC-7721细胞侵袭指数提高。低氧环境下抑制HIF-2α或SCD1表达,HepG2、SMMC-7721细胞侵袭指数较低氧组明显降低(P<0.05);同时抑制HIF-2α和SCD1表达,两种肝癌细胞侵袭能力较低氧组、低氧干扰组及低氧CAY组均明显减少(P<0.05)。低氧组与低氧阴性对照组差异不具显著性(P>0.05)。结论:1、低氧诱导肝癌细胞HIF-2α及SCD1蛋白表达水平上调。2、低氧可能通过HIF-2α—SCD1途径调控肝癌细胞能量代谢,进而影响其生物学行为。