酶解海湾扇贝裙边制备抗氧化肽的研究

来源 :河北农业大学 | 被引量 : 11次 | 上传用户:dxcnet2009
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海湾扇贝在我国渤海东部大范围养殖的珍贵资源,扇贝柱是扇贝中主要的可食部分,然而其它大量的加工废弃物作为废弃物被丢弃。然而这些加工废弃物造成资源的浪费和环境污染。天然抗氧化剂,具有较强的抗氧化活性和较高的安全性,引起国内外研究者兴趣。本文以海湾扇贝裙边为原料,通过酶工程技术及超滤、凝胶层析、反相液相色谱等分离纯化技术制备具有抗氧化活性的扇贝裙边活性肽,为合理、高值利用扇贝裙边提供理论依据。充分开发利用扇贝裙边制备抗氧化肽是重要的研究课题,具有积极的现实意义和广阔的市场前景。本论文在前期研究的基础上,以水解度和超氧阴离子清除率为考察指标,研究中性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶这六种酶水解海湾水解扇贝裙边的效果。结果表明中性蛋白酶水解度和超氧阴离子清除率最高。选用水解温度、加酶量和水解时间三个显著因素对扇贝裙边酶解工艺进行三元二次回归旋转正交法进行优化,并且以水解度和超氧阴离子清除率为考察指标,得到酶解扇贝裙边制备抗氧化肽的最佳条件为:反应温度45℃,pH8,底物浓度4%,加酶量12.9%,反应时间6h。在最优水解条件下测定水解度为30.67%,超氧阴离子清除活性达到25.64%。经过水解得到的酶解液中通常含有多种杂质,比如未水解的扇贝裙边、变性的蛋白酶等。超滤技术是酶解液常用的分离方法。在中性蛋白酶最佳酶解条件下得到扇贝裙边水解液(SSPH)先经过0.45μm的微孔滤膜初滤,去除其中的杂质,采用不同截留分子量(10kDa、5kDa、3kDa、1kDa)的超滤膜对扇贝裙边酶解产物进行初步分离,获得SSPH-Ⅰ(酶解原液)、SSPH-Ⅱ(>10kDa)、SSPH-Ⅲ(10kDa~5kDa)、SSPH-Ⅳ(5kDa~3kDa)、SSPH-Ⅴ(3kDa~1kDa)和SSPH-Ⅵ(<1kDa)六种不同分子量组分。冷冻干燥后配制不同浓度的溶液,比较以上各肽段不同浓度的抗氧化性(DPPH自由基清除率、还原力、超氧阴离子清除率)得到SSPH-Ⅲ的活性组分具有最强的抗氧化活性。利用Sephadex G-50凝胶色谱层析分离纯化组分SSPH-Ⅲ,并优化了凝胶过滤条件为:洗脱液为去离子水,样品的上样浓度为75mg/mL,样品的上样量为0.5mL,洗脱流速为2.0mL/min,检测波长为280nm。在最优的条件下组分SSPH-Ⅲ被分离纯化成了2个组分F1和F2。并分别检测了各组分的DPPH自由基清除能力。结果发现,组分F1表现出最强的DPPH自由基清除能力达到37.16%。利用反相高效液相色潽法(RP-HPLC)对F1进一步分离纯化,色谱条件:色谱柱Hypersil BDS-C18色谱柱(E2017139,250mm×4.6mm,5μm);柱温:30℃;流速:1.0mL/min;进样量:20μL;流动相:10%~70%乙腈(0.05%TFA)梯度洗脱30min。经分离纯化后得到一个峰SSPH-Ⅲ-F1-P。采用液相色谱-线性离子阱/电场回旋轨道组合质谱仪(LTQ Orbitrap)对扇贝裙边抗氧化肽的分子量进行测定,测定出SSPH-Ⅲ-F1-P的m/z值为1206.28。通过多肽分子量计算出分子量为4101.09Da。
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