血管周围间隙(Perivascular spaces, PVS)是在一个多世纪前由德国病理学家R.Virchow和法国生物学、组织学家C.P.Robin提出,后来命名为Virchow-Robin腔(Virchow-Robin space, VRS),也有称之为血管周围淋巴间隙。VRS将血管与周围的脑组织分离开来,是神经系统内的正常解剖结构,目前已成为研究的热点。中枢神经系统内虽然没有真正意义上的衬有内皮细胞的淋巴管,但脑内淋巴引流明确存在,对于维持脑的生理功能具有重要意义。脑内淋巴引流途径阻断后会引起一系列淋巴瘀滞性疾病,即淋巴滞留性脑病(Lymphostatic encephalopathy, LE)。而VRS是脑组织内淋巴系统的重要组成部分,构成脑淋巴管前淋巴系统(Prelymphatic system),它也是疾病传播的途径之一。脑出血(Intracerebral hemorrhage, ICH)是一种严重危害人类健康的常见病。脑出血后血肿周围组织内有“点状出血”,这些“点状出血”病灶常顺着压力差沿着VRS和神经纤维周围间隙等疏松的组织间隙向远端扩展,可堵塞VRS,造成局灶性循环障碍,使VRS局限性扩张。近年来,越来越多学者开始关注ICH是否激活了单核巨噬细胞系统,VRS与免疫反应之间有无联系,中枢神经系统内淋巴循环路径又是怎样的,但到目前为止,尚无明确的证据证实VRS的具体功能及淋巴回流具体的路径。本研究分别通过构建局灶性淋巴滞留性脑病和全脑淋巴滞留性脑病动物模型,及构建高血压脑病后血管源性脑水肿动物模型,研究VRS的改变,旨在探讨大鼠脑内淋巴循环障碍与VRS扩张的关系,及探索VRS与免疫的关系。第一章大鼠局灶性淋巴滞留性脑病动物模型的构建及VRS扩张的病理研究研究目的通过半结扎大鼠脑表面动脉的方法,在不影响全脑功能前提下,构建一种较稳定重复性好的局灶性淋巴滞留性脑病动物模型,观察VRS扩张情况。材料和方法取健康雄性SD大鼠40只(南方医科大学实验动物中心提供),体重250±10g,随机分成24h、48h模型组,24h、48h对照组,各10只。另取健康雄性SD大鼠5只为48h模型组,以台盼蓝(Trypan blue)灌注脑血管。大鼠经10%水合氯醛(0.4ml/100g)腹腔麻醉后,俯卧位固定四肢及头部,颅顶部备皮、消毒,正中纵行切开头皮2cm,30%双氧水腐蚀骨膜暴露前囟,在前囟旁选取开颅点,尽量避开上矢状窦。牙科钻钻孔,直径3-5mm,至硬脑膜表面,揭开硬脑膜,将大鼠移至体视镜下,暴露脑表面动脉,用3/8带针医用尼龙线分离备线,半结扎动脉,确保VRS内腔闭塞,而血管仍保持通畅,不影响远端供血。术后缝合头皮,假手术组大鼠仅开颅分离脑表面动脉,不进行半结扎操作。所有大鼠在同侧注入罗丹明标记牛血清(BSA-TAMRA) 10μl.采用德力凯(elica)脑电图机监测术中大鼠脑电图的变化,对比判断手术前后有无脑缺血等脑功能障碍。所有大鼠灌注固定取脑,冰冻切片,先在荧光显微镜下观察,后行H-E染色,在普通光镜下观察。结果脑电图监测显示术后大鼠未出现脑缺血等脑功能障碍,在光镜下观察台盼蓝灌注模型大鼠可见血脑屏障(Blood-brain barrier, BBB)未受到破坏。在荧光显微镜下可见,大量BSA-TAMRA聚集在半结扎处皮层及皮层下白质VRS内。半结扎的脑表面动脉支配区域的皮层及皮层下均可见明显扩张的VRS,皮层下白质较多见。扩张的VRS周围脑组织结构疏松,着色浅淡。统计分析结果,采用析因分析法,不同组之间差异具有统计学意义(F=94.552,P=0.000)。24h、48h模型组扩张的VRS数目(分别为6.60±2.76个,6.90±2.33个)比24h、48h对照组(分别为0.70±0.68个,1.10±0.99个)增多,差异具有统计学意义(P=0.000);不同时间扩张的VRS数目无统计学差异(F=0.338,P=0.564)；VRS截面积统计学分析：方差齐性检验,F=8.460,P=0.001,方差不齐。采用近似F检验Welch法,F=40.913,P=0.000,具有显著性差异,选择Dunnett T3法进行多重比较。24h模型组(4.09±2.98 um2)和48h模型组(4.08±1.37 um2)与假手术组(0.33±0.30um2)相比,VRS面积扩大具有显著性差(F=40.913,P=0.000)；24h模型组和48h模型组之间无显著性差异(P=1.000)。第二章大鼠脑出血后局灶性淋巴滞留性脑病及VRS扩张的病理研究研究目的为了证实脑出血是否激活了脑内免疫系统,并观察VRS与脑内免疫反应的关系、脑出血后VRS的病理改变,通过顶部入路预置管二次注射自体动脉血的方法,建立大鼠脑出血模型,造成脑局部淋巴循环障碍,采用免疫组化及免疫荧光方法标记CD68及CD4阳性细胞。在荧光显微镜及普通光显微镜下观察脑内阳性细胞。本研究又通过脑内注射自体血与BSA-TAMRA混合液及单独注射BSA-TAMRA,对比观察VRS在颅内具体的循环路径及特点。材料和方法SD雄性大鼠,体重250±10g(由南方医科大学实验动物中心提供),所有大鼠保持在常规实验室温度,能自由饮水进食。1.自体血脑内注射：取20只大鼠,随机分为模型组与对照组,各10只。通过腹腔注射10%水合氯醛(0.4mL/100g)深度麻醉后,将大鼠固定在立体定向仪上,定好位后,用牙科钻在进针点处钻孔,直径1mm,至硬脑膜表面。将24 G静脉留置针经钻孔垂直进针至位于颅骨外表面下6.0mm的靶点,预置管组大鼠预置管留置24h以后,再次用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.4mL/100g),抽取股动脉血于肝素化的20μL微量注射器中。模型组大鼠缓慢注射动脉血10μL(10μL/min)至靶点,静置8min后,以同样速度注射余下10μL血液,留针30min后缓慢拔针,封闭留置管。对照组用同样方法注射等量生理盐水。2.自体血与BSA-TAMRA混合液的制备与颅内注射：运用同样的办法,我们在大鼠左侧大脑半球注入该混合液体。该组随即选取10只SD雄性大鼠,所有大鼠在24h后处死。3.颅内单独注射BSA-TAMRA:30只雄性大鼠被立体定向在左侧大脑半球注入BSA-TAMRAC,并随机分成3个亚组：24h组、48h组、72h组,每组含10只。三个亚组分别在24h、48h及72h处死。所有大鼠麻醉下心脏内灌注4%多聚甲醛固定后取脑,行冰冻切片,经过相应染色(免疫荧光、免疫组化、H-E)后在普通光显微镜及荧光显微镜下观察,采用Mias2000图像分析系统测量每只大鼠脑组织内VRS平均面积(每只大鼠测量10个VRS,取平均值)。SPSS 13.0统计软件进行统计分析。结果1.大鼠脑出血模型免疫荧光、免疫组化观察及H-E染色观察：模型组大鼠脑组织内CD4阳性细胞数目(6.50±2.46个)比对照组(2.80±1.87个)增多,差异具有统计学意义(t=3.783,P=0.001)。模型组大鼠脑组织内有大量CD68阳性细胞聚集在VRS内,在荧光激发下(WB,激发波长460-490nm,吸收波长520nm),呈现绿色荧光,聚集在血管周围。模型组大鼠脑组织内CD68阳性细胞数(13.30±4.67个)比对照组(5.50±1.78个)增多,差异具有统计学意义(t=4.938,P=0.000)。通过免疫组织化学染色后亦可见VRS内有CD68阳性细胞表达,环绕在血管周围。大鼠脑组织行H-E染色可见,脑组织内有大片出血病灶,血肿可沿着VRS向远端扩张,环绕在血管周围。脑出血模型后脑组织行H-E染色,可见脑组织内有大片血肿病灶,血肿可沿着VRS或神经纤维间隙向远端扩散,扩散的血液成分集中分布在血管周围。大鼠脑组织行CD68免疫组织化学染色,亦可见CD68阳性细胞聚集在血管周围间隙,得到的结果与免疫荧光一致。2.自体血与BSA-TAMRA的混合液沿着VRS迁移扩散：在荧光显微镜下(WG,激发波长510-515nm,吸收波长590nm),可见混合液聚集在VRS,呈现红色光点,拍取荧光片后,调换成普通光镜在同一视野下拍摄,后将两者重合作为荧光背景。行H-E染色后光镜下观察,自大脑深部至脑表面血管,混合液沿着血管越来越密集,甚至填堵了,VRS局部扩张。3. BSA-TAMRA在脑内的迁移路径观察：24h组大鼠脑组织内荧光素主要分布在左侧基底节区及皮层。48h组和72h组大鼠,荧光颗粒更为弥散在VRS内,更特别的是,大量的BSA-TAMRA聚集在软脑膜下腔及侧脑室脉络膜。此外,本研究还发现大量的BSA-TAMRA迁移到双侧颈淋巴结内。第三章大鼠全脑淋巴滞留性脑病动物模型的构建及VRS扩张的病理研究研究目的采用结扎并摘除双侧颈深浅淋巴结构建全脑淋巴滞留性脑病模型,脑淋巴液回流受阻,通过免疫荧光染色标记单核巨噬细胞抗体(CD68),在荧光显微镜下观察脑淋巴液回流受阻后,脑内单核巨噬细胞系统的变化,同时观察其迁移路径与VRS的关系,从而进一步探索VRS的功能,探讨VRS与免疫反应的特殊关系。材料和方法取健康雄性SD大鼠40只(南方医科大学实验动物中心提供),体重250+10g,随机分成24h、48h模型组,24h、48h假手术组(开颅分离浅表动脉而不行半结扎),各10只。以标准饲料喂养,自由饮水,饲养温度22-25℃。用结扎并摘取颈部淋巴结的方法制备大鼠淋巴滞留性脑病模型。对照组仅分离颈部淋巴结。将处理好的组织置于冰冻切片机(LEICA CM 1850)内,恒温在-20℃,平衡温度30min后开始切片。将切片行免疫荧光染色后立即置于暗室荧光显微镜(OLYMPUS BX51)下观察(WG,激发波长510-550nm,吸收波长590nm),在同一视野下拍摄荧光片及普通光片,将两者叠加。H-E染色后在光镜下观察并照相。采用Mias2000图像分析系统测量每只大鼠半结扎的脑表面动脉支配区域的VRS平均面积,每只大鼠测量10个VRS,取平均值。同时计数扩张的VRS数目,取平均值。采用SPSS 13.0统计软件分析。P<0.05为具有显著性差异。结果24h模型组大鼠脑组织切片后行H-E染色,在光学显微镜下观察,脑组织皮层、基底节区等部位可见大量VRS扩张,环绕着血管,横断截面呈现圆形或椭圆形环状扩张,在血管纵轴上,VRS呈现血管周围的一条长腔,腔内为透明组织液,有的可见VRS内聚集大量组织细胞。采用析因分析法(表3-1),模型组扩张的VRS数目(10.65±4.10)显著多于对照组(1.95±1.10),(F=81.242,P=0.000)；模型组VRS截面积(6.17±2.49)显著多于对照组(0.39±0.28) (F=107.019,P=0.000)(图3-6)。用免疫荧光方法特染单核巨噬细胞抗体CD68,藻胆色素蛋白(Phycoerythrin, PE)荧光标记二抗标记,在荧光显微镜下观察,可见VRS内聚集较多CD68阳性细胞,环绕在血管周围,呈现红色荧光。48h模型组大鼠脑组织内VRS扩张现象更为明显,数目增多,集中在基底节区及脑膜下,内含有大量细胞聚集。CD68阳性细胞聚集在VRS内,呈红色荧光。不同组之间差异具有统计学意义(F=53.588,P=0.000),模型组CD68阳性细胞数(14.90±5.55)显著多于对照组(5.55±2.19)。第四章大鼠高血压脑病后血管源性脑水肿及VRS扩张的病理研究研究目的通过制备高血压脑病血管源性脑水肿大鼠模型,引起全脑淋巴液生成增多后,采用组织病理学方法观察VRS的变化,探讨VRS扩张机制。材料和方法取健康雄性SD大鼠20只(南方医科大学实验动物中心提供),体重250±10g,随机分成模型组、对照组,每组各10只。以标准饲料喂养,自由饮水,饲养温度22-25℃。模型组10只大鼠分别腹腔注射盐酸去氧肾上腺素(6.0mg/kg),每8h注射一次,共注射三次。对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水。所有大鼠在48h后再次腹腔麻醉,用4%多聚甲醛从心脏经升主动脉灌注固定,剥取脑组织。脑组织采用15%和30%蔗糖溶液梯度脱水,浸入液氮预冷的异戊烷内速冻。冻后的脑组织复温至-20℃后采用冰冻切片机进行冠状面切片,切片厚度10μm。H-E染色后在光镜下观察并照相。显微镜(OLYMPUS)×20视野下,拍取10个不同层面的切片,10个不同的视野,采用Mias2000图像分析系统分析图片,计数扩张的VRS数目及计算VRS截面积,取平均值。采用SPSS 13.0统计软件,比较两组间扩张的VRS数目及截面积差异性,先行方差齐性检验,再进行独立样本t检验。计量数据用均数±标准差(X±s)表示,P<0.05为具有显著性差异。结果在光学显微镜下,对照组大鼠脑组织结构致密,神经细胞核为淡蓝色,神经纤维为红色,血管内无明显残余红细胞,血管壁上可见蓝染的内皮细胞,血管周围未出现明显扩张的VRS；模型组大鼠,脑组织疏松水肿,着色浅淡,血管周围最为明显,扩张的VRS有的呈现椭圆形,有的呈长条形,与血管走向有关。模型组扩张的VRS数目(7.80±2.53)比对照组(1.40±1.26个)增多,差异具有统计学意义(t=7.155,P=0.000)；模型组截面积(4.54±2.35um2)比对照组(0.31±0.27um2)扩大,差异具有统计学意义(t=5.642,P=0.000)。结论1、采用半结扎大鼠脑表面动脉的方法,在不影响全脑功能、不破坏BBB前提下,能构建一种较稳定、重复性好的局灶性淋巴滞留性脑病动物模型。2、局灶性淋巴滞留性脑病后能引起相应皮层及皮层下白质VRS局限性扩张,呈圆形、椭圆形、线性等。3、脑出血后血肿可沿着VRS向周围扩散,或堵塞VRS,造成局灶性淋巴滞留,VRS局部扩张。4、脑出血后脑内单核巨噬细胞系统激活,产生免疫反应。5、脑出血后,大量单核巨噬细胞聚集在VRS内,可沿着VRS随着脑内淋巴循环而迁移到软脑膜下腔及脑室脉络丛。6、VRS是免疫细胞激活并清除异物的场所与通道。7、大量荧光素随着脑内淋巴液从大脑深部循环到软脑膜下腔及脑室脉络丛,最终可以迁移到双侧颈淋巴结。8、脑内淋巴循环与颈部巴结相通。9、结扎并摘除双侧颈部巴结可以引起全脑淋巴回流受阻,脑组织肿胀,全脑大量VRS扩张,散在分布。10、全脑淋巴滞留性脑病后扩张VRS数目及截面积显著增加,全脑淋巴回流受阻是VRS扩张机制之一11、全脑淋巴滞留性脑病可导致单核巨噬细胞系统增生,大量单核巨噬细胞聚集在VRS内,VRS是单核巨噬细胞系统循环的路径之一12、高血压脑病可造成脑组织BBB破坏,脑组织内血管通透性增加,淋巴液生成增多,可导致VRS扩张。13、各种原因导致的BBB破坏是VRS扩张机制之一。