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骨质疏松(Osteoporosis，OP)是一种多病因、多基因复杂疾病。世界卫生组织推荐以骨密度(Bone Mineral Density，BMD)作为OP的诊断标准，但是BMD的改变往往不可逆，且变化周期长，滞后于骨重建失衡，在OP早期发现和疾病机制认识上尚存在较多盲点。外泌体中选择性地富集了某些功能性miRNAs，这些miRNAs在脂质膜的保护下具有充分的生物活性，被转运到效应细胞后可继续发挥基因调控作用。目前，有很多研究均提示外泌体特异性miRNA的水平与疾病的发生和发展存在密切关联。外泌体miRNA是参与骨重建的重要的因子，能在细胞.细胞之间传递生物学信息，对基因的表达起着重要的调控作用。鉴于此，本研究将从以下两个章节着手，筛选并鉴定OP相关血浆外泌体miRNA，并对miRNA与OP相关的细胞分子功能机制进行深入研究。
第一章
研究目的：
基于一项大型骨质疏松调查项目，筛选与骨质疏松相关的血浆外泌体miRNA，并在独立样本中对筛选结果进行验证。
研究方法：
收集老年人群基线资料和生物样本，并使用双能X线骨密度仪检测研究对象腰椎(L1-L4)和髋骨(包括髋部和股骨颈)的BMD值。采用极端取样的方法先选出100例髋部骨密度T值最低的老年女性和100例髋部骨密度T值最高的的老年女性，从中选择9例低骨密度样本和9例高骨密度样本，随机将高骨密度组和低骨密度组的每3个血浆样本混合成1个混合样本，分离混合血浆样本中外泌体RNA后进行初筛检测，鉴定差异表达的miRNA。在样本库中继续选择30例高骨密度女性样本为病例组，匹配年龄因素后选择30例髋部低骨密度女性样本作为对照组，提取血浆外泌体RNA，对发现阶段有意义的miRNA进一步进行RT-PCR验证。为增加结果的稳定性和准确性，在一次验证的基础上，再次以髋部骨密度为标准，在样本库中选择100例髋部高骨密度女性样本为病例组，按照年龄因素匹配后，选择100例髋部低骨密度女性样本作为对照组，提取血浆外泌体RNA，对差异miRNA进行二次RT-PCR验证。
研究结果：
本研究对6，346例65岁以上老年研究对象总髋、股骨颈和腰椎骨密度情况进行了检测，结果发现老年人群中腰椎骨质疏松的患病率最高，达N32.93％，股骨颈骨质疏松的患病率为27.56％，总髋部的骨质疏松发生率为10.97％。骨量减少在老年人中也十分常见，三个部位的骨量减少分别占36.51％，55.39％和53.28％。老年女性中的骨质疏松患病率明显高于男性，腰椎骨质疏松的患病率达至1J47.99％，股骨颈骨质疏松的患病率为40.43％，总髋部骨质疏松患病率也达到了17.84％。初筛和两次独立样本验证中均发现miR-181a-5p(FC=1.77，P=0.02)，miR-30a-3p(FC=1.66，P=0.03)，miR-106b-5p(FC=1.98，P=0.005)在骨质疏松的老年女性的血浆外泌体中出现高表达，且校正了年龄和BMI后，对骨质疏松与血浆外泌体miRAN的表达水平进行Logistic回归，结果显示miR-181a-5p、miR-130a-3p和miR-106b-5p仍然与骨质疏松存在关联(P值均＜0.05)。其中，血浆外泌体中miR-106b-5p的△Ct值与股骨颈骨密度(r=0.16，P=0.02)、髋部骨密度(r=0.20，P=0.005)和腰椎骨密度(r=0.20，P=0.004)都呈正相关，即血浆外泌体中miR-106b-5p表达越高，△Ct值越低，骨密度T值越低。
研究结论：
1骨质疏松是老年人群常见的慢性疾病，尤其在老年女性中具有很高的患病率，在股骨颈、总髋部和腰椎三个部位中，腰椎骨质疏松的患病率最高。
2miR-130a-3p，miR-181a-5p和miR-106b-5p在老年女性骨质疏松患者的血浆外泌体中高表达。
3其中，血浆外泌体中miR-106b-5p的表达与股骨颈、髋部和腰椎骨密度都具有相关性，血浆外泌体中miR-106b-5p表达越高，骨密度越低。
第二章
研究目的：
基于第一章的结果，围绕miR-106b-5p开展细胞实验，明确其对成骨细胞和破骨细胞的调控机制，并探索其靶基因和作用机制。
研究方法：
构建miR-106b-5p过表达的MC3T3-E1和Raw264.7细胞稳转株及阴性对照。采用无外泌体血清培养液培养细胞后，分离出细胞培养液中的外泌体RNA，采用RT-PCR检测细胞培养液中miR-106b-5p的表达量，明确内源性miR-106b-5p是否可从骨质疏松相关的细胞分泌到细胞外基质中。采用CCK-8细胞增殖毒性试验检测miR-106b-5p过表达对细胞增殖的影响、采用PI染色和Annexin V/PI双染法分别检测miR-106b-5p过表达对细胞周期凋亡的影响。通过ALP活性染色检测miR-106b-5p过表达对成骨分化的影响，TRACP活性染色检测miR-106b-5p过表达对破骨分化的影响。利用骨吸收板检测miR-106b-5p过表达后Raw264.7细胞的骨吸收情况。通过RT-PCR和转录组测序检测miR-106b-5p过表达细胞中OP相关的基因的表达情况。
研究结果：
miR-106b-5p过表达的MC3T3-E1细胞的培养液中miR-106b-5p的表达明显升高(FC=3.06)，miR-106b-5p过表达的的Raw264.7细胞的培养液中miR-106b-5p的表达水平也明显升高(FC=4.93)。miR-106b-5p过表达可使MC3T3-E1的增殖能力下降，G1期的细胞比例增加，S期的细胞比较减少，通过阻滞细胞从G1期进入S期阻滞细胞的生长周期。经分化培养7天后，过表达的MC3T3-E1细胞ALP染色比对照细胞浅，表明miR-106b-5p过表达抑制了其向骨细胞进行分化。miR-106b-5p过表达对Raw264.7细胞的增殖、周期和凋亡影响不大，但能在一定程度上促进Raw264.7细胞迁移，促进破骨细胞的骨吸收功能。RT-PCR结果显示在miR-106b-5p过表达的MC3T3-E1细胞中ALP(FC=0.52)，OCN(FC=0.04)，OPN(FC=0.31)，Runx2(FC=0.60)，SMAD5(FC=0.47)，BMP2(FC=0.22)和MAPKl(FC=0.01)呈现低表达。在miR-106b-5p过表达的Raw264.7细胞中Ctsk(FC=1.56)，Oscar(FC=2.49)和Tracp(FC=1.69)呈现一定程度的高表达。MC3T3-E1细胞转录组测序共发现在miR-106b-5p过表达的细胞中293个基因表达上调，380个基因表达下调，这些基因在骨质疏松相关的GO条目中有富集。
研究结论：
1、内源性miR-106b-5p可以从骨相关的细胞分泌到细胞外基质中。
2、miR-106b-5p可能通过抑制成骨细胞的增殖和分化来抑制骨形成，并在一定程度上增加骨吸收，从而使骨量减少、骨密度下降。
3、miR-106b-5p过表达抑制SMAD5，BMP2，MAPK1等基因的表达，与miR-106b-5p过表达相关的基因参与在如骨矿化调节，骨化，骨盐沉积等与骨质疏松相关的生物学功能。
第一章
研究目的：
基于一项大型骨质疏松调查项目，筛选与骨质疏松相关的血浆外泌体miRNA，并在独立样本中对筛选结果进行验证。
研究方法：
收集老年人群基线资料和生物样本，并使用双能X线骨密度仪检测研究对象腰椎(L1-L4)和髋骨(包括髋部和股骨颈)的BMD值。采用极端取样的方法先选出100例髋部骨密度T值最低的老年女性和100例髋部骨密度T值最高的的老年女性，从中选择9例低骨密度样本和9例高骨密度样本，随机将高骨密度组和低骨密度组的每3个血浆样本混合成1个混合样本，分离混合血浆样本中外泌体RNA后进行初筛检测，鉴定差异表达的miRNA。在样本库中继续选择30例高骨密度女性样本为病例组，匹配年龄因素后选择30例髋部低骨密度女性样本作为对照组，提取血浆外泌体RNA，对发现阶段有意义的miRNA进一步进行RT-PCR验证。为增加结果的稳定性和准确性，在一次验证的基础上，再次以髋部骨密度为标准，在样本库中选择100例髋部高骨密度女性样本为病例组，按照年龄因素匹配后，选择100例髋部低骨密度女性样本作为对照组，提取血浆外泌体RNA，对差异miRNA进行二次RT-PCR验证。
研究结果：
本研究对6，346例65岁以上老年研究对象总髋、股骨颈和腰椎骨密度情况进行了检测，结果发现老年人群中腰椎骨质疏松的患病率最高，达N32.93％，股骨颈骨质疏松的患病率为27.56％，总髋部的骨质疏松发生率为10.97％。骨量减少在老年人中也十分常见，三个部位的骨量减少分别占36.51％，55.39％和53.28％。老年女性中的骨质疏松患病率明显高于男性，腰椎骨质疏松的患病率达至1J47.99％，股骨颈骨质疏松的患病率为40.43％，总髋部骨质疏松患病率也达到了17.84％。初筛和两次独立样本验证中均发现miR-181a-5p(FC=1.77，P=0.02)，miR-30a-3p(FC=1.66，P=0.03)，miR-106b-5p(FC=1.98，P=0.005)在骨质疏松的老年女性的血浆外泌体中出现高表达，且校正了年龄和BMI后，对骨质疏松与血浆外泌体miRAN的表达水平进行Logistic回归，结果显示miR-181a-5p、miR-130a-3p和miR-106b-5p仍然与骨质疏松存在关联(P值均＜0.05)。其中，血浆外泌体中miR-106b-5p的△Ct值与股骨颈骨密度(r=0.16，P=0.02)、髋部骨密度(r=0.20，P=0.005)和腰椎骨密度(r=0.20，P=0.004)都呈正相关，即血浆外泌体中miR-106b-5p表达越高，△Ct值越低，骨密度T值越低。
研究结论：
1骨质疏松是老年人群常见的慢性疾病，尤其在老年女性中具有很高的患病率，在股骨颈、总髋部和腰椎三个部位中，腰椎骨质疏松的患病率最高。
2miR-130a-3p，miR-181a-5p和miR-106b-5p在老年女性骨质疏松患者的血浆外泌体中高表达。
3其中，血浆外泌体中miR-106b-5p的表达与股骨颈、髋部和腰椎骨密度都具有相关性，血浆外泌体中miR-106b-5p表达越高，骨密度越低。
第二章
研究目的：
基于第一章的结果，围绕miR-106b-5p开展细胞实验，明确其对成骨细胞和破骨细胞的调控机制，并探索其靶基因和作用机制。
研究方法：
构建miR-106b-5p过表达的MC3T3-E1和Raw264.7细胞稳转株及阴性对照。采用无外泌体血清培养液培养细胞后，分离出细胞培养液中的外泌体RNA，采用RT-PCR检测细胞培养液中miR-106b-5p的表达量，明确内源性miR-106b-5p是否可从骨质疏松相关的细胞分泌到细胞外基质中。采用CCK-8细胞增殖毒性试验检测miR-106b-5p过表达对细胞增殖的影响、采用PI染色和Annexin V/PI双染法分别检测miR-106b-5p过表达对细胞周期凋亡的影响。通过ALP活性染色检测miR-106b-5p过表达对成骨分化的影响，TRACP活性染色检测miR-106b-5p过表达对破骨分化的影响。利用骨吸收板检测miR-106b-5p过表达后Raw264.7细胞的骨吸收情况。通过RT-PCR和转录组测序检测miR-106b-5p过表达细胞中OP相关的基因的表达情况。
研究结果：
miR-106b-5p过表达的MC3T3-E1细胞的培养液中miR-106b-5p的表达明显升高(FC=3.06)，miR-106b-5p过表达的的Raw264.7细胞的培养液中miR-106b-5p的表达水平也明显升高(FC=4.93)。miR-106b-5p过表达可使MC3T3-E1的增殖能力下降，G1期的细胞比例增加，S期的细胞比较减少，通过阻滞细胞从G1期进入S期阻滞细胞的生长周期。经分化培养7天后，过表达的MC3T3-E1细胞ALP染色比对照细胞浅，表明miR-106b-5p过表达抑制了其向骨细胞进行分化。miR-106b-5p过表达对Raw264.7细胞的增殖、周期和凋亡影响不大，但能在一定程度上促进Raw264.7细胞迁移，促进破骨细胞的骨吸收功能。RT-PCR结果显示在miR-106b-5p过表达的MC3T3-E1细胞中ALP(FC=0.52)，OCN(FC=0.04)，OPN(FC=0.31)，Runx2(FC=0.60)，SMAD5(FC=0.47)，BMP2(FC=0.22)和MAPKl(FC=0.01)呈现低表达。在miR-106b-5p过表达的Raw264.7细胞中Ctsk(FC=1.56)，Oscar(FC=2.49)和Tracp(FC=1.69)呈现一定程度的高表达。MC3T3-E1细胞转录组测序共发现在miR-106b-5p过表达的细胞中293个基因表达上调，380个基因表达下调，这些基因在骨质疏松相关的GO条目中有富集。
研究结论：
1、内源性miR-106b-5p可以从骨相关的细胞分泌到细胞外基质中。
2、miR-106b-5p可能通过抑制成骨细胞的增殖和分化来抑制骨形成，并在一定程度上增加骨吸收，从而使骨量减少、骨密度下降。
3、miR-106b-5p过表达抑制SMAD5，BMP2，MAPK1等基因的表达，与miR-106b-5p过表达相关的基因参与在如骨矿化调节，骨化，骨盐沉积等与骨质疏松相关的生物学功能。