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生物大分子（如蛋白质）的结构与功能研究是现代生物学的重要研究领域。定点自旋标记结合电子顺磁共振（Site-Directed Spin Labeling ElectronParamagnetic Resonance，SDSL-EPR）技术是目前可以在生理环境下研究蛋白质分子结构的主要方法之一。SDSL-EPR技术利用SDSL技术在生物分子内的目的位点选择性地标记上含有未偶自旋的氮氧自由基，再通过EPR技术测量未偶自旋的波谱状态，通过波谱解析，可以获得标记位点的运动状态和两个未偶自旋间的距离及其变化。其距离测量方法的特点是测距范围宽，受其它因素影响小，对蛋白质结构和构象变化分析更加有效。SDSL-EPR可研究溶液中类似生理环境下的蛋白质，更加适合用于测量结构变化的动态过程，解决了许多生物学研究中的难点问题，例如难以获得结晶的蛋白质结构分析、膜蛋白和大分子蛋白复合体的构象分析、溶液状态下蛋白质的动态变化、蛋白质之间和蛋白质与膜之间的相互作用等。SDSL-EPR距离测量方法目前仍然存在一些问题：由于生物样品的多样性，实际测量中许多因素都可能引起连续波电子顺磁共振（Continues Wave ElectronParamagnetic Resonance，CW-EPR）波谱增宽，包括待标记位点的不完全标记、生物分子的整体运动和自旋标记侧链的局部运动、自旋弛豫效应、测量温度以及波谱测量参数选择等，这些因素都会引入距离测量误差。然而，目前所有的CW-EPR距离计算方法均难以完全避免上述因素对距离测量准确度的影响。因此，如何有效地从EPR波谱中分辨并提取出未偶自旋相互作用导致的波谱增宽，就成为CW-EPR距离测量方法需解决的核心问题。本工作的目的是针对目前SDSL-EPR距离测量方法在生物分子结构与功能研究中的现状，建立EPR测量生物大分子内位点之间距离的实验方法和新的距离校准与刻度方法，提高CW-EPR测量距离的准确度和精度，为在溶液或生理环境下研究蛋白质的结构与功能的关系建立新的技术方法。方法：（1）在傅立叶去卷积距离计算（Fourier Deconvolution DistanceMeasurement，FDDM）方法基础上，编写波谱拟合-傅立叶去卷积计算方法（Spectrum Simulation-Fourier Deconvolution Distance Measurement，SS-FDDM）与增宽函数高斯拟合相结合的新的距离计算软件；通过优化波谱拟合过程，增加波谱和增宽函数的高斯拟合程序和双自旋波谱的反向拟合程序，改善波谱拟合效果；通过在距离计算环节中增加对单/双自旋波谱以及增宽函数的校正程序，提高距离计算的精度；运用新的距离计算软件计算距离已知的双自旋化合物的距离，检验软件的实际应用效果并对软件加以改进。（2）在CW-EPR测距范围内建立不同条件下（不同溶剂、浓度、温度、功率等）测量微量溶液样品中未偶自旋相互作用导致的波谱增宽效应的实验方法；合成具有刚性骨架结构、分子尺寸确定、结构稳定的系列单/双自旋化合物作为距离刻度标尺，在不同条件下建立客观的距离校准和刻度方法。（3）运用蛋白质分子构建距离测量的生物实验模型：选用肝脏免疫调控蛋白肝脏及淋巴结窦内皮细胞C型凝集素（the human liver andlymph node sinusoidal endothelial cell C-type lectin，hLSECtin）的糖基识别结构域（carbohydrate-recognition domains，CRD）为模板，在其钙离子结合区域设计单/双半胱氨酸（Cys）突变体，利用定点自旋标记技术将单/双未偶自旋引入模型样品，通过pET28b-Tat原核表达载体表达模型样品，为后期测量未偶自旋间距离的变化特性并对所建立方法进行应用和验证奠定基础。结果：（1）综合应用EPR波谱拟合、增宽函数的高斯拟合和双自旋波谱反向拟合等方法，改进了原有的距离计算方法（SS-FDDM）；通过比较不同条件下C60双自旋分子的距离计算结果，证明新的计算方法对波谱的处理更灵活，扩大了波谱拟合软件的适用范围，特别是对低温粉末谱的有效拟合，能有效消除实验谱的高频噪音，并可去除人工确定增宽函数截止点的过程，在一定程度上克服人为因素的影响，对距离计算的准确性和客观性均有提高；新的波谱拟合-距离计算软件基本可以适用于大部分未偶自旋相互作用的EPR波谱解析和去卷积计算。（2）构建了三种双自旋间距不同的以C60为骨架的双自旋化合物作为距离刻度标尺。实验表明C60双自旋分子尺寸确定、分子稳定、骨架结构刚性好，满足距离刻度标尺的要求，且在结构上优于同类实验采用双螺旋核酸结构或炔-苯骨架结构的标尺。结合不同条件下的距离测量结果，优化了微量溶液样品中未偶自旋相互作用导致的波谱增宽效应的实验条件，建立了不同条件下（不同溶剂、浓度、温度、功率）的距离刻度方法和校正标准；目前的距离刻度范围为8~14，综合各种条件获得的距离测量精度约为0.84。（3）成功构建了单/双Cys点突变hLSECtin-CRD结构域蛋白模型，通过pET28b-Tat载体实现了六组单/双Cys点突变蛋白模型的高效可溶性表达，并获得了初步纯化的样品，为进一步开展hLSECtin-CRD的构象变化分析提供了条件。结论：本工作提出了用双自旋化合物分子对EPR测量距离进行校正与刻度并建立相应实验方法的设想。改进并编制了新的CW-EPR距离计算软件；在8-14范围建立了稳定的双自旋距离刻度分子标尺及其距离刻度与校正的实验方法；完成了单/双Cys点突变体距离测量蛋白质实验模型的构建。课题研究结果已基本达到了建立EPR测量生物大分子内位点之间距离方法的目的。本工作的不足之处体现为：目前的波谱拟合程序还有进一步完善与优化的空间，尤其是使增宽函数高斯拟合方法能适用于更复杂的增宽函数；还可设计合成更长距离的双自旋化合物，进一步拓展距离刻度标尺的范围；通过蛋白质实验检验距离计算方法的实际应用效果。