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猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是严重危害我国生猪产业的重要病原。研究病毒编码蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用对于理解PRRSV的致病机制具有十分重要的意义。本研究在筛选、鉴定与PRRSV蛋白相互作用的细胞蛋白的基础上,进一步分析了Nsp3与IFITM1、E蛋白与Tetherin、Nsp2与CD2AP之间相互作用的分子机制及其生物学意义,以期为阐明PRRSV的致病机制提供科学依据。分别将含有PRRSV各个基因(除Nsp6和Nsp8)的酵母质粒pGBKT7转化酵母菌Y2H,进行细胞毒性和自激活实验,结果表明,PRRSV的各个基因编码的蛋白无细胞毒性和自激活现象。应用猪肺泡巨噬细胞(PAMs) cDNA文库和酵母双杂交技术,分别筛选与Nsp2、Nsp9、Nsp10、Nsp11和Nsp12相互作用的细胞蛋白,将阳性克隆进行了质粒提取和测序分析,并在NCBI上进行序列比对,确定了相应序列对应的基因和相互作用的候选蛋白。分别从PAMs中克隆固有抗病毒因子IFITM1、IFITM3、Tetherin、PKR、OAS、Mx1、ISG15和ISG56基因,并将克隆的片段构建到pGADT7载体上,然后分别与病毒基因的pGBKT7诱饵质粒共转染酵母菌Y2H,并在选择培养基上进行相互作用的筛选,结果发现Nsp3与IFITM1、E与’Tetherin之间存在相互作用。采用免疫共沉淀证实了固有抗病毒因子IFITM1与Nsp3、Tetherin与E之间的相互作用。激光共聚焦分析表明,在质粒转染和PRRSV感染细胞中,IFITM1主要分布于细胞核的周围,而Tetherin能够部分地从细胞膜转移。此外,在MARC-145细胞中过表达IFITM1和Tetherin都不能明显的抑制PRRSV的增殖。进一步分析表明,在PRRSV感染过程中,Nsp3可通过蛋白酶体途径降解IFITM1。这些发现提示,PRRSV可能通过Nsp3与IFITM1、E与Tetherin之间的相互作用而拮抗IFITM1和Tetherin的抗病毒作用,为理解PRRSV逃逸宿主免疫监视提供了新的视角。用免疫共沉淀技术验证了Nsp2能够与外源性和内源性的CD2AP发生相互作用,并通过酵母双杂交技术确定了它们的相互作用区域,结果表明,Nsp2高变区与CD2AP的SH3domains相互作用；激光共聚焦分析显示,Nsp2与CD2AP共定位于细胞核的周围。对病毒感染过程中蛋白表达变化的分析表明,Nsp2能够通过组织蛋白酶L (CatL)降解CD2AP;干扰CD2AP表达能够抑制PRRSV的增殖和Nsp2在细胞内的表达。进一步对PRRSV感染过程中CD2AP可能参与的细胞骨架和细胞凋亡调控进行了分析,结果表明,Nsp2介导的CD2AP的降解能够破坏正常的细胞骨架和导致细胞分裂的缺陷；干扰CD2AP的表达有利于PRRSV感染早期诱导的TGF-β1的分泌,并且Nsp2能够通过激活Smad3通路促进TGF-β1诱导的细胞凋亡；在这一过程中,PRRSV可诱导dendrin蛋白的入核,核内的dendrin够促进胞质中CatL的表达和增强TGF-β1介导的细胞凋亡。最后,对PRRSV感染猪肺脏中细胞骨架和诱导凋亡的效应分子CatL和TGF-β1进行了免疫组化分析,结果显示,两者主要分布在巨噬细胞、气管上皮细胞和肺泡上皮细胞。上述研究结果揭示了Nsp2参与病毒的细胞致病的机制,为阐释PRRSV感染引起的部分细胞病理变化提供了科学依据。综上所述,我们的研究揭示了PRRSV Nsp3与IFITM1、E与Tetherin、Nsp2与CD2AP之间的相互作用及其生物学意义,为理解和阐释PRRSV致病的分子机制提供了重要的科学依据。