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第一部分自身免疫性心肌炎小鼠miR-155和Th17/Treg表达研究目的：检测实验性自身免疫性心肌炎(EAM)小鼠miRNA-155表达情况和Th17/Treg细胞相关免疫反应。方法：建立BABL/C小鼠α肌球蛋白重链(MyHC-α)来源多肽诱导的EAM模型;观察并比较各组小鼠心脏和脾脏外观变化,测量并比较各组小鼠体重变化、心脏质量/体重比率(HW/BW)、心脏质量/胫骨长度比值(HW/TL)和脾脏总淋巴细胞数：HE染色检测小鼠心脏组织病理改变；原位杂交检测小鼠心肌组织miR-155表达情况；RT-PCR检测小鼠心肌组织、外周血单个核细胞,脾脏淋巴细胞,脾脏CD4+T细胞的miR-155表达情况；Western blot和RT-PCR检测小鼠心肌组织Th17相关细胞因子(RORγt、IL-6、IL-17A)表达情况；流式检测小鼠脾脏CD4+T细胞的Th17细胞比例和Treg细胞比例,以及小鼠脾脏CDllc+树突状细胞(DCs)比例；Western blot和RT-PCR检测Th17相关细胞因子(RORγt、IL-17A、IL-21、IL-22)和Treg相关细胞因子(TGF-β、IL-10、IL-35)表达情况,以及CD11c+DC表达促Th17细胞分化炎症因子(IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-23)水平；磁珠分选EAM小鼠和正常对照小鼠的CD4+CD25+foxp3+Treg细胞和CD4+CD25-效应性T细胞体外进行混合培养和交叉培养,检测EAM模型小鼠Treg细胞抑制功能。结果：与健康对照组相比,EAM模型小鼠心肌组织、外周血单个核细胞,脾脏CD4+T细胞的miR-155表达明显升高,并且.免疫组化显示,小鼠心肌组织表达的miR-155主要位于炎症侵润部位,而末受损的心肌组织则miR-155表达不明显；EAM模型小鼠心肌组织Th17相关细胞因子(RORγt、IL-6、IL-17A)表达明显升高；EAM模型小鼠脾脏CD4+T细胞的Th17细胞比例明显升高,同时Th17相关细胞因子(RORγt、IL-17A、IL-21、IL-22)表达明显升高；EAM模型小鼠脾脏CD4+T细胞的Treg细胞比例相比对照组无明显变化,但Treg细胞相关细胞因子(TGF-β、IL-10= IL-35)表达明显升高；EAM模型小鼠脾脏CD11c+DCs比例升高,DC表达促Th17细胞分化炎症因子(IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-23)水平升高。CFSE标记效应性T细胞检测Treg细胞抑制功能试验表明EAM模型小鼠脾脏来源的Treg细胞抑制功能无明显变化,但其CD4+CD25-效应T细胞对Treg细胞抑制作用的反应敏感度明显降低。结论：EAM小鼠心肌组织及脾脏CD4+T细胞miR-155表达明显升高,同时EAM小鼠存在明显的Th17/Treg细胞失衡,一方面表现为增殖失衡,即CD4+T细胞的Th17细胞比例明显升高,而Treg细胞虽然也有增殖但其比例无明显变化；另一方面表现为功能失衡,即Thl7细胞对Treg细胞的抑制功能产生抵抗,而Treg细胞的本身的抑制功能并无明显变化；EAM小鼠体内CD11c+DCs分泌促Th17细胞分化所需炎症因子的水平明显增加。第二部分MiR-155促进自身免疫性心肌炎小鼠Th17细胞的分化和功能目的：探索miR-155对实验性自身免疫性心肌炎(EAM)中Th17和Treg细胞分化及其功能的影响；研究体内抑制miR-155对自身免疫性心肌炎的治疗作用。方法：建立BALB/c小鼠EAM模型。通过尾静脉注射miRNA-155抑制剂(antagomir-155)抑制小鼠体内miR-155的表达,尾静脉注射PBS作为抑制剂对照。动物分组：对照组(尾静脉注射PBS),对照组(尾静脉注射antagomir-155), EAM模型组(尾静脉注射PBS), EAM模型组(尾静脉注射antagomir-155)。观察并比较各组小鼠心脏外观变化,测量并比较各组小鼠体重变化,心脏质量/体重比率(HW/BW),心脏质量/胫骨长度比值(HW/TL),脾脏总淋巴细胞数；组织病理学检查和心脏超声检查比较各组小鼠心肌炎程度及心脏形态功能变化；RT-PCR检测各组小鼠心肌组织、PBMCs、脾脏淋巴细胞的miR-155表达情况；Western blot和RT-PCR检测各组小鼠心肌组织Thl7相关细胞因子(RORyt、IL-6、IL-17A)表达情况；免疫组化检测EAM模型小鼠IL-17A表达情况；分离EAM模型小鼠心肌炎性细胞,流式检测Th17细胞表达情况；流式检测各组小鼠脾脏CD4+T细胞的Th17细胞比例和Treg细胞比例,以及小鼠脾脏CDllc+树突状细胞(DCs)比例；Western blot和RT-PCR检测Th17相关细胞因子(RORyt、IL-17A、IL-21、IL-22)和Treg相关细胞因子(TGF-β、 IL-10、IL-35)表达情况,以及CD11c+DC表达促Th17细胞分化炎症因子(IL-6、 TNF-α、IL-1β、L-23)水平。分离两组EAM模型小鼠脾脏细胞体外进行MyHC-α614-629多肽特异性增殖反应,比较两组小鼠来源CD4+T细胞增值状况及分泌IL-17A细胞因子水平。结果：与尾静脉注射PBS的EAM模型组小鼠对比,antagomir-155处理的EAM模型小鼠具有以下变化：心肌组织、PBMCs、脾脏淋巴细胞的miRNA-155表达明显降低;心肌炎症侵润、坏死、纤维化明显改善；体重减轻百分比,HW/BW、HW/TL及总淋巴细胞数明显降低；心脏形态及功能明显改善；心肌组织Th17细胞及其相关因子(RORyt、IL-6、IL-17A)明显减少；小鼠脾脏CD4+T细胞的Th17细胞比例和Treg细胞比例,以及小鼠脾脏CD11c+DCs比例明显减少;小鼠脾脏CD4+T细胞Th17相关细胞因子(RORγt、IL-17A、IL-21、IL-22)和Treg相关细胞因子(TGF-β、IL-10、IL-35)表达明显降低;小鼠脾脏CD11c+DC表达促Th17细胞分化炎症因子(IL-6、 TNF-α、IL-1β、IL-23)明显减少。MyHC-α多肽特异性增殖反应显示antagomir-155处理的EAM模型小鼠来源CD4+T细胞体外抗原特异性增殖反应明显降低,并且分泌IL-17A细胞比例也明显降低。结论：通过尾静脉注射miR-155抑制剂antagomir-155可以特异性干预小鼠体内miR-155的表达及其功能；体内抑制miR-155对EAM小鼠起着明显的心脏保护作用,说明miR-155促进EAM的发生发展；体内抑制miR-155能够明显减弱EAM小鼠Th17细胞的活化及其促炎效应,说明miR-155通过促进Th17细胞的分化和功能介导EAM小鼠Th17/Treg失衡；体内抑制miR-155明显降低了EAM小鼠CD1lc+DCs的表达及其分泌Th17细胞极化因子的水平,说明miR-155可通过促进DCs的分化和分泌炎症因子的功能间接促进Th17细胞的表达。第三部分体外研究miR-155对Th17细胞和树突状细胞的分化及功能的影响目的：通过体外过表达或抑制miRNA-155的细胞培养实验进一步研究miR-155对Th17细胞和骨髓来源树突状细胞(BMDCs)的分化及其功能的影响。方法：磁珠分选健康BALB/C小鼠脾脏CD4+T细胞,分别体外转染miR-155类似物(agomir-155)、miR-155抑制剂(antagomir-155)和各自对照剂(agomir-NC和antagomir-NC),再进行Th17细胞分化培养。收集培养上清液ELISA检测各组细胞IL-17A分泌情况;流式检测各组细胞Th17细胞分化比例；RT-PCR检测各组细胞miR-155、Th17细胞相关因子(1L-17A、RORγt、STAT3)及miR-155靶基因SOCS-1表达情况。分离健康BALB/c小鼠骨髓细胞,体外刺激诱导BMDCs生成,转染antagomir-155或antagomir-NC, LPS刺激成熟。收集培养上清液ELISA检测各组细胞促炎因子IL-6、IL-23、TNF-α和IL-1β分泌情况;流式检测各组细胞表面标志MHC Ⅱ、CD86、CDllc表达情况；RT-PCR检测各组细胞miR-155,促炎因子IL-6、IL-23、 TNF-α和IL-1β,以及miR-155靶基因SOCS-1、PU.1、SHIP-1表达情况。结果：过表达miR-155的CD4+T细胞体外分化Th17细胞比例、分泌IL-17A细胞因子、关键转录因子RORyt及STAT3信号转导因子表达都明显增加,而miR-155靶基因SOCS-1表达则明显降低；miR-155表达受抑制的CD4+T细胞体外分化Th17细胞比例、分泌IL-17A细胞因子、关键转录因子RORyt及STAT3信号转导因子表达都明显降低,而miR-155靶基因SOCS-1表达则明显增加。miR-155表达受抑制的BMDCs经LPS刺激后其成熟表面标志MHC Ⅱ、CD86、CD11c表达无明显变化,而分泌炎因子IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-23的功能则明显降低,同时miR-155靶基因SOCS-1、PU.1、SHIP-1表达则相应明显增加。结论：MiR-155对CD4+T细胞分化至Th17细胞起着关键性的作用,同时miR-155能促进树突状细胞分泌促Th17细胞分化所需炎症因子的功能。