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隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种重要的人畜共患寄生性原虫,其宿主范围广泛,可以感染包括人在内的240多种动物;由其所引起的隐孢子虫病对人畜危害严重。本文应用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法对河南省规模化鸡场隐孢子虫病进行流行病学调查,并通过感染雏鸡试验和基于18S rRNA基因的巢式PCR扩增,对获得的部分分离株进行了致病性和分子生物学特性研究,以期为隐孢子虫病的分子流行病学研究和防治提供理论依据。1、为了解河南省规模化鸡场隐孢子虫病感染情况,笔者于2006年8月至2007年7月用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法对河南省部分规模化鸡场进行了调查。共调查10个地市的8个规模化鸡场和37个中小规模养殖户,检查样品2015份。结果表明蛋鸡、种鸡隐孢子虫感染率为10.57%(163/1542),肉鸡感染率为3.17%(15/473),其中0～31、31～60d的雏鸡和121～180d初产蛋鸡感染率相对较高,分别为13.70%、24.60%和12.87%。育成鸡(60～120d)和产蛋鸡(180d以后)的感染率相对较低为2.96%、4.78%。根据形态数据初步鉴定为贝氏隐孢子虫(C. baileyi)。数据分析显示,鸡隐孢子虫在3至5月春季感染率最高,12至次年2月冬季感染率最低。2、用分离于初产蛋鸡的隐孢子虫卵囊接种3d雏鸡,观察研究其排卵囊规律和临床症状,并通过组织切片及电镜观察寄生部位。结果表明:潜隐期4d,排卵囊开放期18d,高峰期感染后7～14d。主要引起呼吸道症状。组织切片及电镜观察可在喉头、气管、法氏囊、泻殖腔等部位发现虫体寄生。3、根据发表的隐孢子虫18S rRNA基因序列,对32个隐孢子虫分离株进行了巢式PCR扩增,产物序列长度均为837 bp左右;用限制性内切酶SspI和VspI对PCR产物进行消化酶切确定种类和基因型。SspI酶切结果:28个隐孢子虫分离株酶切后产生573bp,267bp两个片断,4个分离株产生450bp,267bp,111bp片断;VspI酶切结果:28个隐孢子虫分离株酶切后产生621bp,115bp,104 bp片断,4个分离株产生457bp,171bp,115bp片断。根据酶切片断初步确定感染鸡的隐孢子虫有两种C. baileyi和C. meleagridis。4、为从种系发育关系确定分离株的种类或基因型,利用巢式PCR对32个隐孢子虫分离株进行18S rRNA基因扩增,并对扩增片段进行测序,测序后的序列用Blast在NCBI、EMBL和DDBJ三大核酸序列数据库搜索同源序列,然后利用ClustalX1.81、Phylip3.65和DNAStar4.0等生物学软件对序列进行比对、构建分子进化树以及同源性分析。根据在18S rRNA基因位点种系进化关系分析,确定了28个分离株为C. baileyi,且分离株在同一进化枝上,为同一种;4个分离株与GenBank中的EF641025、EF179381在同一进化枝上,为同一种。由此可以确定感染鸡的隐孢子虫主要为C. baileyi和C. meleagridis。根据本次流行病学调查结果和国内外文献资料综合分析发现,隐孢子虫在河南省鸡场广泛存在;种类鉴定分析表明鸡感染的隐孢子虫为C. baileyi和C. meleagridis,其中C. baileyi为优势种。从产蛋鸡分离的隐孢子虫感染雏鸡证明C. baileyi主要寄生于鸡的法氏囊和呼吸道。基于18S rRNA基因的巢式PCR扩增和酶切鉴定种及种系进化关系分析证实,28个分离株为C. baileyi ,4个分离株为C.meleagridis。11个分离株部分碱基发生突变。本次试验为掌握河南省鸡场隐孢子虫分子流行动态提供了参考依据,为控制人畜共患隐孢子虫病的爆发提供理论基础,具有一定公共卫生意义。