核因子κB受体活化因子配体(RANKL)是肿瘤坏死因子家族的重要成员之一,除了在骨免疫学中发挥重要作用外,其在黏膜免疫尤其是在调控M细胞的分化等方面日益受到科学家们的高度关注,而M细胞是肠道黏膜免疫的关键门户。基于此,本研究在体外表达猪源RANKL,纯化后分析其生物学功能,以期为提高猪肠道黏膜免疫应答提供科学依据和物质基础。为获得生物学活性良好的猪RANKL蛋白,本研究采用昆虫/杆状病毒真核表达系统。首先将猪RANKL基因克隆到pFastBacHTA载体后,经PCR鉴定和双酶切验证以及序列测定,最终获得正确的pFastBacHTA-RANKL重组质粒。随后将重组供体质粒pFastBacHTA-RANKL转化至DH10BAC高效感受态细胞制备杆粒,经两轮蓝白斑筛选,选取白色菌落进行扩大培养,采用PCR鉴定,结果表明本试验成功构建了表达猪RANKL的重组杆粒。将重组杆粒转染至sf9昆虫细胞后,观察细胞病变,收获细胞并裂解后采用SDS-PAGE、Western-bloting以及IFA验证目标蛋白的表达状况,结果表明重组杆状病毒能够正确表达猪RANKL蛋白。将接毒后的sf9细胞进行超声裂解,将超声后的细胞上清进行镍柱纯化,将不同梯度的咪唑洗涤后,采用250 mM的咪唑洗脱RANKL蛋白,经过SDS-PAGE和Western-bloting鉴定,目的蛋白大小为40kDa。采用纯化后的猪RANKL蛋白分别处理猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)和小鼠肠道3D类器官,采用qPCR方法检测处理后细胞中M细胞相关标志基因的表达情况。结果显示,与阴性对照组相比,猪RANKL蛋白处理后的IPEC-J2细胞中M细胞特异性的表面标志基因CK-18、Marcksl1、Sgene1、Gp2、RANK、SpiB、CCL20、UBD、NCF4、TRAF6表达量均显著上调;此外,猪RANKL同样可诱导鼠肠道3D类器官中M细胞相关基因上调表达。上述结果表明,本研究表达纯化的猪RANKL具有良好的生物学活性,为后续进一步研究猪肠道M细胞的分化打下了良好的物质基础,也为研制增强猪肠道黏膜免疫应答的M细胞靶向疫苗提供了科学依据。