研究背景:我国是肝脏疾病高发国家之一,根据2018年国际癌症研究机构（IARC）的一份报告显示。中国有多达700万人（或0.5%）患有肝硬化,每年有46万肝癌新发病例[1]。各种慢性肝病最终可能发展为肝硬化、肝癌,严重危害我国人民健康,造成了沉重的经济负担。肝纤维化是影响肝病预后的关键因素。肝纤维化作为早期肝硬化阶段,研究纤维化的发病机制,可以为改善早期肝硬化提供治疗思路,对于提高患者生活质量和降低社会的经济负担具有重要的现实意义。肝纤维化是各种慢性肝病导致合成瘢痕组织的细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）合成过多和/或降解减少导致ECM在肝脏内过度沉积的一种损伤修复反应[2]。ECM的主要来源是肝星状细胞（Hepatic stellate cell,HSC）。因此,HSC成为防治肝纤维化的重要靶细胞,如何抑制其活化、增殖是抗肝纤维化研究的焦点。HSC是肝脏间质细胞之一,正常情况下HSC呈静止状态,在病理条件下HSC增殖并激活,转变为肌成纤维细胞（MFB）,表达α-平滑肌动蛋白（α-smoothmuscleactin,α-SMA）,合成肝组织中细胞外基质等。在CC14和TAA诱导的大鼠肝纤维化模型中,HSC活化的减少可以显著地减弱肝纤维化以及肝脏损伤[3]。美国病理学家Dixit于1990年研究内皮细胞对肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor,TNF）诱导应答的基因时,发现内皮细胞经TNF、IL-1和LPS刺激时,均能够迅速高水平生成的一条特殊基因[4],其可读框编码一种新型的金属蛋白,命名为锌指蛋白A20,简称A20。已有报道中A20是参与机体炎症反应和细胞凋亡的主要调控基因之一。肝纤维化包括多种复杂的病理生理过程,其进程中的炎性因子异常升高,A20表达增加,可能与其反应性抑制炎症反应进程有关,进而参与肝纤维化的发生发展。然而A20在肝纤维化发生发展进程中的作用以及潜在机制尚需进一步研究探讨[5]核转录因子-κB（Nuclear factor-κB,NF-κB）由同源或者异源二聚体组成,调控机体的多种生物学功能。NF-κB在肝损伤过程中往往被持续激活,可促进HSC活化、增殖以及抑制其凋亡,导致ECM合成增加,加速肝纤维化的发生发展。现有研究发现,锌指泛素化酶A20/肿瘤坏死因子α诱导蛋白3（tumor necrosis factor alpha-inducible protein 3,TNFAIP3,即 A20）在免疫反应中可抑制 NF-κB 信号通路的激活从而抑制炎症和免疫反应。那么,A20是否能通过调控NF-κB通路抑制HSC活化进而发挥抗肝纤维化的作用呢?目前报道尚未完全阐明,仍需进一步研究。第一部分A20在肝纤维化进程中的表达水平及临床相关性研究目的:观察在人体不同分期肝纤维化组织中A20的表达水平,结合临床数据分析肝纤维化程度与A20表达水平的相关性;观察不同人群外周血液中A20与肝纤维化的关系。方法:1.应用流式细胞术检测健康志愿者以及肝纤维化患者的外周血PBMC（Peripheralbloodmononuclearcell,外周血单个核细胞）中锌指蛋白A20的表达水平。2.选取2019.06-2021.06山西医科大学第一医院81例慢性肝病患者和19例对照组的病例资料和病例标本进行HE染色、Masson染色并通过病理分析进行纤维化程度分期。3.使用免疫组化染色检测上述样本肝组织中α-SMA、Collagen I、FN的蛋白表达。4.使用免疫组化检测锌指蛋白A20在肝组织内的表达情况,并采用Spearman统计方法对其与肝脏病理纤维化分期的相关关系进行分析。5.相应实验结果均使用统计软件SPSS（22.0）进行统计学分析。检测的数据结果采用均数±标准差（x±S）进行统计学描述,其中组间差异采用单因素方差分析（ANOVA）比较,两两比较采用Tukey’s multiple comparisons test进行统计学分析。检验水准 α=0.05,*P＜0.05。结果:1.肝纤维化组患者外周血PBMC中锌指蛋白A20相对表达量明显低于健康对照组（P＜0.01）。2.共收集2019年06月至2021年06月山西医科大学第一医院81例慢性肝病患者,其中男57例,女24例,年龄27～69岁。按中华医学会肝病学分会《肝纤维化诊断及治疗共识（2019年）》诊断标准进行肝纤维化程度分级。对照组为19例,男13例,女6例,年龄23～67岁,为肝血管瘤、肝囊肿手术患者及腹部外伤、肝破裂手术患者。均已签署知情同意书,标本取材前经伦理委员会审批通过。3.对肝组织α-SMA、CollagenI、FN的蛋白表达进行半定量分析。随着肝纤维化程度的增加,α-SMA、CollagenI、FN蛋白表达量增加,与正常组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。4.肝组织中随着纤维化程度的加重,A20表达水平提高,S0期分别与S1-S4各期相比,表达差异有统计学意义;S1分别与S3、S4期比较差异有统计学意义,S2分别与S3、S4比较有统计学差异（P＜0.05）。结论:A20在肝纤维化患者外周血中呈低表达,肝组织中高表达,且锌指蛋白A20在肝组织中的表达水平与肝纤维化分期程度密切相关,今后可能成为评估肝纤维化严重程度或诊断肝纤维化的新分子标志物。第二部分A20在肝星状细胞系以及TAA诱导小鼠肝纤维化模型中的作用研究目的:探究A20表达改变后在体外对肝星状细胞系的活化、功能和成纤维能力的调节作用;观察上调A20后对TAA诱导的小鼠肝纤维化模型的影响。方法:1.敲减A20后对肝星状细胞系LX-2功能的影响（1）采用qPCR技术检测肝星状细胞LX-2中A20的本底表达情况。（2）选取合适的质粒转染进细胞系LX-2后,下调A20的基因表达。并采用qPCR技术进行特异性siRNA干扰效率检测,采用Wesren Blot方法,在蛋白水平检测A20表达。（3）下调LX-2细胞系中A20表达后,采用qPCR技术检测ACTA2、Collagen I、FN在mRNA水平的表达情况,用Western Blot技术检测在蛋白水平表达情况。采用CCK8试剂盒检测细胞活性,用Transwell实验检测细胞迁移能力,用流式细胞术检测细胞凋亡情况和细胞周期的改变。通过ELISA技术检测细胞上清液中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-10的表达情况。2.过表达A20后对肝星状细胞系LX-2功能的影响通过转染质粒使细胞系LX-2上调A20表达并使用qPCR的方法进行验证。待LX-2过表达A20后,采用qPCR技术检测ACTA2、CollagenI、FN在mRNA水平的表达情况,用Western Blot技术检测在蛋白水平表达情况。采用试剂盒通过检测CCK8检测细胞活性,用Transwell实验检测细胞迁移能力,用流式细胞术检测细胞凋亡情况和细胞周期的改变。通过ELISA技术检测细胞上清液中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-10的表达情况。3.过表达A20对TAA诱导的模型小鼠肝纤维化进程的影响（1）将3月龄,体重为20～25g的SPF级C57小鼠40只进行TAA腹腔注射制作肝纤维化模型。腹腔注射浓度为10mg/ml TAA,注射剂量为0.1ml/10g,2次/w,连续给药6w。同时设置生理盐水组,注射等量的生理盐水。（2）将TAA造模成功的小鼠随机分为TAA组、TAA+空载病毒组、TAA+A20组和生理盐水组,并进行相应处理。（3）待上述实验1、2完成后,实验小鼠经异氟烷醚气麻后,脱颈椎处死,取完整肝组织称重。取部分小鼠肝组织,进行HE染色、Masson染色,并分析比较。另取部分肝组织,采用qPCR技术检测A20的基因表达、免疫组化技术检测A20组织表达。4.相应实验结果均使用统计软件SPSS（22.0）进行统计学分析。检测的数据结果采用均数±标准差（x±S）进行统计学描述,其中组间差异采用单因素方差分析（ANOVA）比较,两两比较采用Tukey’s multiple comparisons test进行统计学分析。检验水准 α=0.05,*P＜0.05结果:1.敲减A20对肝星状细胞的影响LX-2检测（1）LX-2中有一定A20的表达,可用于后续实验。（2）与野生型LX-2细胞相比,在LX-2细胞系中降低A20表达后,在mRNA水平升高了 ACTA2、CollagenI、FN的表达。在蛋白水平升高了 FN1和α-SMA的表达。提高了细胞增殖活性和迁移能力,降低了凋亡率,使得G0/G1期细胞比例降低,细胞增殖活跃。上调了上清液中炎症因子TNF-α、IL-6的表达,降低了 IL-10的表达（P＜0.05）。2.与野生型LX-2细胞相比,在LX-2细胞系中过表达了 A20后,在mRNA水平降低了 ACTA2、Collagen I、FN的表达。在蛋白水平降低了 FN1和α-SMA的表达。降低了细胞活性和迁移能力,升高了凋亡率,使得G0/G1期细胞比例升高,细胞增殖减慢。降低了上清液中炎症因子TNF-α、IL-6的表达,升高了 IL-10的表达（P＜0.05）。3.A20在体内对C57小鼠的肝纤维化的影响（1）通过小鼠肝组织HE染色、Masson染色结果分析,小鼠腹腔注射TAA成功制造肝纤维化模型。（2）在TAA+A20组小鼠肝脏组织中,A20在mRNA水平和蛋白水平表达均升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。（3）相对于TAA+空载病毒组,TAA+A20组小鼠肝纤维化有所减轻,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:（1）在细胞系LX-2中,降低A20的表达,可以上调纤维化相关蛋白的表达含量,增加炎症因子的表达,说明肝星状细胞活化增强。反之亦然。（2）在小鼠体内过表达A20,减轻了 TAA模型小鼠的肝纤维化程度。第三部分初探A20在肝纤维化进程中的作用机制目的:筛选上调肝星状细胞中A20表达后,参与调控的信号通路;初步探讨A20通过p65抑制NF-κB信号通路的作用机制。方法:（1）通过蛋白互作,收集可与A20直接或间接结合的蛋白分子,然后对收集到的蛋白质进行质谱检测,确定收集蛋白的种类。将获得的质谱结果中筛选出的蛋白分子在Metascape网站进行对比和通路分析（网址:http://Metascape.org）,进而筛选出,在过表达A20的肝星状细胞中,能够与A20结合并参与其调控的关键靶点和相关信号通路。（2）通过免疫共沉淀技术,检测并验证A20与NF-κB信号通路的互作关系。结果:1.肝星状细胞中A20调节的信号通路（见下表）。2.经Co-IP验证p65是肝星状细胞中A20调控NF-κB信号通路的靶标之一。结论:A20在肝星状细胞中通过调控NF-κB信号通路中的p65分子,从而抑制肝星状细胞的活化。研究背景:原发性肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）,在我国主要是指肝细胞肝癌,是世界上最常见的恶性肿瘤之一,目前,在我国常见恶性肿瘤中排名第4位,而在致死的肿瘤种类中排名第2位,是主要的致死肿瘤。严重威胁我国人民的生命和健康[6,7]。HCC的发病机制已有非常多的研究,但是仍然有很多机制没有明确的定论,虽然多激酶抑制剂在HCC的治疗中取得了一定的进展,但效果非常有限。因此,探索关键的分子靶标仍然是今后研究的热点。锌指蛋白A20是一类具有特征性锌指结构的蛋白,是机体炎症反应主要的参与分子,以及调控细胞凋亡等生命过程的重要分子。根据已有的一些报道,A20在多种肿瘤来源的细胞系及肿瘤组织中异常表达,可能参与肿瘤细胞的增殖、耐药和血管形成等相关功能活动[8,9],但作用机制尚未明确。有研究表明,A20可能通过抑制肝脏炎症进程进而减轻肝细胞恶性增殖[10]。A20是否可以抑制肝癌细胞增殖、迁移并促进其凋亡,目前少见相关报道。第四部分A20在肝癌中的表达水平及临床相关性研究目的:观察A20在肝癌肝组织中的表达水平;分析A20在肝癌中的表达与临床数据的相关性。方法:1.选取2019.06-2021.06山西医科大学第一医院54例肝癌患者的病例资料2.将所选患者病理样本进行HE染色,并通过病理分析进行分期。3.使用免疫组化检测锌指蛋白A20在不同肝组织内的表达情况。4.将A20肝组织表达和其相对应的临床病理资料进行统计学分析。5.相应实验结果均使用统计软件SPSS（22.0）进行统计学分析。检测的数据结果采用均数±标准差（x±S）进行统计学描述,其中组间差异采用单因素方差分析（ANOVA）比较,两两比较采用Tukey’s multiple comparisons test进行统计学分析。检验水准 α=0.05,*P＜0.05结果:1.研究纳入2019年06月至2021年06月山西医科大学第一医院行肝脏穿刺活检、肝切除术或肝脏移植手术,并经术后病理证实为肝细胞肝癌患者54例。男41例,女13例,年龄29～74岁。术前均已签署知情同意书,本研究得到山西医科大学第一医院伦理委员会审批批准。2.将上述患者的病理样本进行HE染色并按照WHO肝细胞肝癌分级标准进行分级。3.所收集的病例样本中,A20在肝癌组织中的表达较其配对的癌旁肝组织中表达有升高趋势,差异没有统计学意义。结论:A20在肝癌样本中表达与癌旁组织比较有升高趋势,但差异无统计学意义,需要扩大样本研究。第五部分细胞水平探讨A20在肝癌恶性增殖中的作用目的:研究A20对肝癌细胞系功能的影响。方法:1.通过qPCR技术检测肝癌细胞系Huh7和M97H中A20的本底表达情况。2.选取合适的质粒可以在细胞系Huh7和M97H中降低A20的表达含量。3.采用质粒转染技术,在Huh7和M97H中敲低A20,并采用qPCR技术进行表达含量的验证。敲低A20后,分别采用CCK8检测肝癌细胞系的增殖水平,Transwell实验检测细胞迁移能力。采用流式细胞术检测细胞凋亡情况和周期改变。4.通过质粒转染使细胞系Huh7和M97H过表达A20并使用qPCR的方法进行验证。待Huh7和M97H过表达A20后,采用CCK8试剂盒检测细胞增殖,用Transwell实验检测细胞迁移能力,用流式细胞术检测细胞凋亡情况和细胞周期的改变。5.相应实验结果均使用统计软件SPSS（22.0）进行统计学分析。检测的数据结果采用均数±标准差（x±S）进行统计学描述,其中组间差异采用单因素方差分析（ANOVA）比较,两两比较采用Tukey’s multiple comparisons test进行统计学分析。检验水准 α=0.05,*P＜0.05结果:（1）肝癌细胞系Huh7、M97H中均有A20的表达,可用于后续实验。（2）与野生型Huh7、M97H细胞相比,在Huh7、M97H细胞系中分别降低A20的表达后,提高了细胞活性和迁移能力,降低了凋亡率,使得G0/G1期细胞比例降低,细胞增殖活跃（P＜0.05）。（3）与野生型Huh7、M97H细胞相比,在Huh7、M97H细胞系中分别提高A20的表达后,降低了细胞活性和迁移能力,提高了凋亡率,使得G0/G1期细胞比例升高,细胞增殖减缓（P＜0.05）。结论:通过在肝癌细胞系中敲减或过表达A20,进而影响细胞的增殖、迁移、凋亡等功能,提示A20在肝癌进程中发挥一定的作用。