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第一部分:血管生成相关蛋白在Ⅲ期压疮形成中的表达及意义 目的:建立Ⅲ期压疮动物模型,观察HIF-1α、VEGF、KDR蛋白在Ⅲ期压疮形成过程中的动态变化,探讨HIF-1α介导的血管再生障碍在Ⅲ期压疮形成中的作用。 方法:将40只SD雄性大鼠按随机数字表法分为正常对照组、受压3d组、受压5d组、受压7d组、受压9d组,每组8只。正常对照组大鼠不做任何处理,后4组大鼠应用缺血-再灌注循环磁片压迫的方式,在大鼠两侧后肢股薄肌处建立压疮动物模型。受压3d组大鼠受压3个循环(受压12h,放松12h为1个循环)后不做任何处理,受压5d组、受压7d组、受压9d组大鼠在受压3个循环后,划破受压皮肤,后分别继续施压至5、7、9个循环。受压3d组大鼠于受压后3d(正常对照组大鼠于相同时间点),另3组大鼠分别于受压后5、7、9d,切取双侧股薄肌中心部位的皮肤组织。肉眼观察创面愈合情况;HE染色观察皮肤病理组织学变化;Western blot检测皮肤组织HIF-1α、 VEGF蛋白动态变化;免疫组化检测KDR蛋白表达。对数据进行单因素方差分析。 结果: 1.肉眼观察结果显示,随着受压时间延长,组织损伤程度逐渐加重,皮肤颜色由苍白变黄,肌肉组织肿胀。从受压5d开始,皮肤组织出现破损。 2.形态学观察显示,与正常对照组相比,各实验组表皮增厚,皮肤附属器减少,炎症细胞浸润明显,微血管数量随受压时间延长而逐渐减少。 3.Western blot结果显示,正常对照组仅有极少量HIF-1a蛋白表达,各实验组大鼠皮肤组织HIF-1a表达总体呈先上升后下降的趋势。和正常对照组比较,受压3d时HIF-1a表达量增加明显(P<0.05),从受压5d开始表达逐渐下降,在受压9d时表达量最低。VEGF和HIF-1α蛋白表达趋势相同。 4.免疫组化结果显示:KDR阳性蛋白主要表达在细胞质,和正常对照组比较,受压3d组蛋白表达增加(P<0.05),从受压5d组开始表达下降,并随着受压时间延长表达逐渐减少。 结论:HIF-1α低表达引起VEGF和KDR蛋白表达减少,可能是Ⅲ期压疮皮肤难以愈合的潜在关键因素。 第二部分:外源性碱性成纤维细胞生长因子对Ⅲ期压疮血管再生的修复机制 目的:通过观察外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对大鼠Ⅲ期压疮血管再生的修复作用,探讨其促进血管再生的可能机制,以期为进一步研究Ⅲ期压疮难愈机制及临床压疮治疗靶点提供理论依据。 方法:采用Ⅲ期压疮大鼠模型,将60只大鼠随机分为6组(n=10),即正常对照组、损伤对照组和实验组(4d、7d、14 d、21 d)。损伤对照组即造模完成后的第0d,在去除伤口局部的坏死组织后,每天于实验大鼠的右侧局部受压部位覆盖适当大小的纱布(大小为1×1cm),用rh-bFGF均匀喷湿纱布(以药液不溢出为准),用创可贴适当包扎;左侧以喷有相同体积生理盐水的纱布覆盖、包扎,每组于损伤后的第4d、7d、14d、21d对局部组织取材并给予安乐死。HE染色观察皮肤组织病理学变化。免疫组化观察VEGF、KDR、HIF-1α和CD31的蛋白表达变化。免疫荧光检测α-SMA蛋白在组织修复过程中的表达变化。Westernblot检测局部皮肤组织不同修复时间点MMP-2、PCNA蛋白表达及信号通路相关蛋白Akt磷酸化情况。 结果: 1.组织病理学观察:HE染色结果显示在各个观察时间点,bFGF给药组肉芽组织生长、血管新生等促组织修复现象均优于NS对照组,上皮化速率更快。 2.Western blot结果显示:损伤对照组MMP-2蛋白表达较少,第4d、第7d、第14d时,bFGF干预组大鼠皮肤组织MMP-2表达量均明显高于NS对照组(P值均小于0.05),第7d时两组MMP-2表达量相近,差异无统计学意义(P>0.05)。损伤对照组PCNA蛋白表达极少。在不同的修复时间点,bFGF干预组PCNA表达量均高于NS对照组(P值均小于0.05),21d时表达量最高。 3.免疫组化检测结果显示:损伤对照组VEGF蛋白表达极少;与NS对照组相比,bFGF干预组大鼠皮肤组织VEGF表达量均增加明显(P值均小于0.05)。4d时表达最高,7d时表达略减少,14d时表达增加,修复后期VEGF阳性颗粒减少。损伤对照组KDR蛋白表达极少;bFGF干预组KDR量均较NS对照组增加(P值均小于0.05),整体呈逐渐减少的趋势。4d时表达最高,7d时表达出现急剧减少,修复后期KDR阳性颗粒少量增加。bFGF干预组大鼠皮肤组织中HIF-1α表达量在不同修复时间点(4d、7d、14d、21 d)均明显高于NS对照组(P值均小于0.05),与VEGF蛋白表达趋势一致。 4.Western blot检测信号通路相关蛋白的表达,结果以目的蛋白P-Akt与Akt灰度比值表示。实验组的Akt磷酸化水平呈先下降后上升趋势,在第4d时表达最高,7d出现下降,修复后期表达量轻度上升。bFGF组Akt磷酸化水平表达均高于NS对照组(P值均小于0.05)。 5.免疫组化检测结果显示:损伤对照组CD31表达极少;不同修复时间点(第4d、第7d、第14d、第21d),bFGF干预组大鼠皮肤组织中CD31表达量均较NS对照组明显增加(P值均小于0.05)。 6.免疫荧光检测α-SMA蛋白表达。bFGF干预组和NS对照组大鼠皮肤组织中α-SMA表达量均在第4d达表达高峰,之后呈逐渐下降的趋势。bFGF干预组α-SMA表达量在各时间点均明显高于NS对照组(P值均小于0.05)。 结论: 1.外源性bFGF可通过促进细胞基底膜降解、调节损伤区域修复细胞增殖,调控血管生成相关蛋白,促进Ⅲ期压疮创面血管再生。 2.PI3K/Akt/HIF-1α通路相关蛋白磷酸化表达增强,说明外源性bFGF促进Ⅲ期压疮血管生成的机制可能和血管生成相关信号通路蛋白表达增强有关。 3.bFGF不仅可使静脉数量增加,还可促进动脉生成,为组织修复提供充足的氧气和营养。