目的：肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，S.pn）是人类主要致病菌，在临床上广泛引起中耳炎、败血症、脑膜炎及致死性肺炎等多种疾病。全球每年大约有160万人死于肺炎链球菌引起的各种疾患。尽管抗生素治疗是控制肺炎链球菌感染的有效手段，但并不能有效降低肺炎链球菌感染最初48小时的死亡率。随着抗生素的滥用，临床上耐药菌株明显增加。因此，通过接种肺炎链球菌疫苗以预防其感染成为积极有效的手段。新一代的蛋白疫苗是预防肺炎链球菌感染的未来发展方向，但目前国际上对蛋白质疫苗尚处于临床前研究阶段，由于单一蛋白的保护效果并不理想，联合蛋白疫苗是目前研究的热点。采用多种肺炎链球菌毒力蛋白联合免疫，以扩大其对机体的保护效应是一种可行方式,因为蛋白抗原联合疫苗提供了多种毒力作用的潜在靶标。Gts、PotD和SrtA蛋白都是肺炎链球菌的重要毒力因子，生物信息学分析显示其在肺炎链球菌中保守性高，且均在细菌表面有表达，但尚未有报道对其作为疫苗候选蛋白进行系统的免疫保护效果评价。本研究拟先比较肺炎链球菌Gts、PotD和SrtA单个蛋白抗原免疫小鼠后，对肺炎链球菌感染的保护作用；然后采用不同血清型的肺炎链球菌，检测上述蛋白两两联合、三种蛋白组合后免疫小鼠，与单个蛋白抗原组比较，以评价其对肺炎链球菌感染的保护效果。方法：本研究首先通过基因克隆、蛋白表达及纯化技术，成功制备了肺炎链球菌Gts、PotD及SrtA重组蛋白。重组蛋白经鼻腔免疫途径，以研究抗原特异性反应，并检测其体液和细胞调节反应。为了模拟肺炎链球菌感染的自然途径，以评价Gts、PotD及SrtA重组蛋白抗原对小鼠鼻腔感染后的保护效果，选择肺炎链球菌中致病能力最强的D39菌株进行鼻腔攻毒实验，以构建肺炎链球菌性肺炎的小鼠模型。为了更充分地评估Gts、PotD和SrtA重组蛋白不同组合对多种血清型肺炎链球菌感染的保护效果，本研究采用上述重组蛋白抗原经小鼠腹腔免疫，然后选择不同血清型肺炎链球菌进行腹腔攻毒实验研究。再次采用特异性抗血清免疫小鼠后，选择D39肺炎链球菌进行鼻腔攻毒实验，以鉴定重组蛋白抗原的保护性是否由其特异性抗体介导的。采用细胞粘附实验，以分析Gts、PotD和SrtA重组蛋白及其特异性抗血清对D39细胞粘附于A549细胞的影响；最后，为了进一步探讨人体经肺炎链球菌感染后，该细菌表面抗原Gts、PotD和SrtA刺激机体产生的天然抗体滴度变化，本研究收集正常人群及急性肺炎患者，拟采用ELISA法测定血清中anti-Gts、anti-PotD及anti-SrtA抗血清的滴度变化。结果：在成功克隆和表达Gts、PotD和SrtA重组蛋白基础上，通过Western blot分析证实，CMCC（B）31216(serotype9V)、CMCC (B)31436(serotype3)、CMCC(B)31507(serotype7F)等8种血清型的肺炎链球菌均能表达Gts、PotD和SrtA蛋白，且蛋白抗原性未发生变异。粘附抑制实验证实，单一Gts、PotD和SrtA蛋白都能抑制D39对A549细胞的粘附，且2-3个蛋白质抗原的联合使用，具有明显的累加效应。此外，抗-Gts、抗-PotD和抗-SrtA抗血清的单独使用或2-3个抗血清的联合使用，也具有和蛋白抗原类似的抑制效应。通过鼻腔滴注Gts、PotD或SrtA重组蛋白，小鼠脾细胞产生了高水平的Th1介导的细胞因子IFN-γ、Th2介导的细胞因子IL-4、Treg介导的IL-10因子和Th17介导的细胞因子IL-17A，诱导了小鼠对肺炎链球菌的粘膜免疫及系统免疫。在构建的肺炎球菌感染的小鼠模型中，Gts、PotD或SrtA重组蛋白重组通过粘膜途径免疫小鼠，均能有效减少19F型肺炎链球菌在鼻咽部及肺部的定植。与单个蛋白抗原比较，Gts+SrtA、PotD+Gts+SrtA均能显著提高肺炎链球菌对肺部定植的保护作用。3个蛋白抗原联合粘膜免疫后，对肺炎链球菌中致病能力最强的D39血清型鼻腔感染保护率可达83.3%。腹腔免疫结果与粘膜免疫类似，几乎所有蛋白抗原联合都较单个蛋白的保护作用更强。但与蛋白两两组合比较，Gts+PotD+SrtA的三联蛋白抗原的联合腹腔免疫，其保护作用并未见明显加强。被动免疫研究提示，抗-Gts、抗-PotD和抗-SrtA抗血清联合免疫小鼠，其对小鼠腹腔感染肺炎链球菌的保护作用与主动免疫的效果相似，提示Gts、PotD及SrtA蛋白抗原通过主动免疫激发的保护效应与其抗体的作用密切相关。结论：通过本研究的分析显示，Gts、PotD及SrtA在肺炎链球菌中的保守性高，三种蛋白联合抗原的两两组合及三种联合，通过粘膜免疫途径或系统性免疫途径免疫小鼠，均能诱导小鼠对不同血清型肺炎链球菌感染的显著保护效果，显示Gts、PotD及SrtA是一组有开发潜力的候选疫苗组合。目的：大量表达、纯化肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae, S.pn）外膜蛋白SPD1741及SPD0280，用于晶体生长、优化和三维结构解析。方法：分别将S.pn D39菌株的spd1741、spd0280基因克隆至原核表达载体pET32a(+)中，通过菌液PCR和重组质粒测序鉴定，再转化E. coli BL21(DE3)获得表达菌株；该菌株经IPTG诱导、高效表达出带His标签的可溶性融合蛋白；经亲和层析(Ni-NTA)、离子交换层析（DEAE）和分子筛层析后,获得高纯度的目的蛋白以进行晶体生长及优化；最后收集该晶体X射线衍射数据。结果：经纯化后的SPD1741及SPD0280重组蛋白纯度均达90%以上，采用悬滴气相扩散法培养的晶体，其X射线衍射能力分别达4.0和3.5。结论：本研究成功制备了高纯度的SPD1741及SPD0280重组蛋白,获得2种蛋白质母体晶体，并收到X射线衍射数据。本研究为SPD1741及SPD0280的三维结构解析及其生物学功能研究奠定了基础。