论文部分内容阅读
目的:支气管哮喘是一种涉及基因和环境相互作用的复杂疾病,但哮喘的病因仍不完全清楚,气道上皮细胞在肺内环境及外部环境之间提供了重要的保护层。气道上皮细胞是气道的第一道屏障,通过纤毛摆动,释放抗微生物肽,趋化因子,细胞因子,招募并激活其他类型的免疫细胞来清除病原体。气道上皮细胞损伤后通过加强促炎活性,释放生长因子等参与支气管哮喘的气道炎症与气道重塑。多项研究表明哮喘患者气道上皮细胞自噬水平增高的,E-cadherin在哮喘上皮细胞中表达下调。HMGB1是一种晚期炎症因子,近期研究显示HMGB1在哮喘患者的诱导痰及肺泡灌洗液中表达升高。HMGB1是一种核蛋白,应激后可转移至胞浆进而释放至胞外。HMGB1与自噬及氧化应激的关系极为密切,为明确HMGB1相关自噬与气道上皮细胞EMT转化关系,本研究进行了相关的动物及细胞实验。研究方法:一、动物实验1.动物模型建立及分组:雌性BALB/C小鼠分为对照组,哮喘组,3-MA组,EP组及BUD组。模型以OVA加氢氧化铝致敏,2%OVA激发每周5次,共4周。对照组以PBS替代,3-MA组激发前1h腹腔注射15mg/kg 3-MA,EP组激发前1h腹腔注射75mg/kg EP,BUD组激发前雾化2mg BUD。2.无创肺功能检测:于末次雾化吸入24小时至48小时内检测小鼠肺功能,测定不同浓度Mch下的penh值。3.肺泡灌洗液细胞分类计数及ELISA检测:2%戊巴比妥钠（50mg/ml）麻醉小鼠,静脉留置针行气管插管,1ml无菌注射器抽取0.5ml无菌PBS沿留置针注入后回收,重复三次,回收量均大于80%。留取的肺泡灌洗液4℃3000 rpm/min,离心10min。沉淀重悬后甩片,瑞氏-吉姆萨染色,细胞分类计数。上清按照ELISA试剂盒说明书检测HMGB1水平。4.肺组织病理染色:左肺多聚甲醛固定后石蜡包埋,行肺组织切片。左肺切片分别用HE、AB-PAS、MASSON染色评估气道炎症、杯状细胞化生及上皮下胶原沉积情况。5.免疫组化染色:左肺组织切片常规脱蜡,抗原修复,α-SMA、HMGB1、E-cadherin、及Vimentin一抗孵育过夜后二抗孵育2h,DAB显色。6.Western blot:提取组织蛋白,BCA蛋白定量,制作蛋白样品,12%SDS-PAGE跑胶,PVDF膜转膜,牛奶阻滞,抗体孵育后ECL发光液发光。二、细胞实验1.细胞培养:HBE细胞用含10%胎牛血清的培养基培养,自噬诱导以EBSS作用不同时间（1h,2h,4h及6h）以及不同浓度的雷帕霉素（0.1μM,0.2μM,0.4μM及0.6μM）作用24h。3-MA抑制剂在自噬诱导前给予含2m M 3-MA的培养基预处理24h,EP在自噬诱导前给予含终浓度为10m M丙酮酸乙酯的培养基预处理24h。2.质粒转染过表达HMGB1及si RNA沉默转染HMGB1:种板12.5cm2的培养瓶,待细胞融合度达到80%进行过表达及沉默实验,过表达予6μg c DNA及18μl的lipo 2000,沉默予20μM si RNA及10μl Lipo 2000进行转染。3.免疫荧光:24孔板细胞爬片,给予不同处理条件,最终细胞融合度约30-40%,进行免疫荧光实验,倒置显微镜采图。结果:一、HMGB1相关自噬在支气管哮喘小鼠气道上皮细胞间质转化中的作用1.3-MA抑制自噬可显著抑制气道炎症及气道高反应3-MA组小鼠的肺泡灌洗液内细胞总数、嗜酸性细胞数量显著下降,HE染色亦显示气道周围炎性细胞数量减少,MASSON染色示上皮下胶原沉积减少及AB-PAS示杯状细胞化生减少。小动物肺功能显示3-MA组小鼠气道反应性较哮喘组显著下降。2.3-MA抑制自噬可降低哮喘气道上皮细胞的EMT水平3-MA抑制剂组小鼠肺组织切片免疫组化及western blot结果显示3-MA组小鼠上皮细胞E-cadherin升高,N-cadherin及Vimentin升高。3.EP抑制HMGB1转移后可抑制气道炎症及气道高反应性EP组免疫组化显示EP可抑制气道上皮细胞HMGB1的转移,胞浆HMGB1表达减少,同时小鼠的肺泡灌洗液内细胞总数明显减少,嗜酸性细胞减少。HE染色显示肺组织炎性细胞浸润好转,MASSON染色示上皮下胶原沉积减少及AB-PAS示杯状细胞化生减少。小动物肺功能显示EP组小鼠气道反应性较哮喘组显著下降。4.EP抑制HMGB1转移后可抑制气道上皮细胞自噬水平电镜显示3-MA组及EP组气道上皮内的自噬小体显著下降,蛋白电泳显示3-MA组及EP组自噬水平下降。5.EP抑制HMGB1转移后可降低哮喘气道上皮细胞的EMT水平EP抑制组较哮喘组升高气道上皮细胞E-cadherin表达,降低N-cadherin及Vimentin表达。二、HMGB1通过自噬导致气道上皮细胞间充质转化的研究1.饥饿及RAP诱导自噬可导致气道上皮细胞HBE出现EMT EBSS饥饿诱导自噬及RAP诱导自噬均可导致气道上皮细胞E-cadherin下降,N-cadherin及Vimentin升高。予3-MA抑制自噬水平后EBSS及RAP诱导的EMT水平会下降。2.HMGB1蛋白及过表达HMGB1均可导致气道上皮细胞EMT HMGB1蛋白作用于HBE细胞显示EMT水平随作用时间及作用浓度的增加而增加,过表达HMGB1显示过表达的HBE细胞胞浆中有HMGB1高表达,过表达的HBE细胞同样出现E-cadherin下降,N-cadherin及Vimentin升高。3.抑制自噬可减轻HMGB1诱导的EMT HMGB1及过表达HMGB1均可导致HBE细胞自噬水平升高,3-MA抑制自噬后HBE细胞的EMT水平下降。4.EP及沉默HMGB1可抑制EBSS诱导的EMT予EP预处理HBE细胞后再次予EBSS诱导自噬,HBE细胞的EMT水平较未处理组明显下降,予沉默HMGB1的HBE细胞EBSS诱导自噬,同样显示EMT水平下降。结论:3-MA抑制自噬及EP抑制HMGB1转移后可显著降低OVA哮喘小鼠气道上皮细胞的自噬水平,减轻气道炎症,降低气道高反应性,减轻上皮间充质转化水平。细胞实验进一步证明EBSS或RAP诱导的自噬均可导致HBE细胞发生EMT,HMGB1蛋白及过表达HMGB1同样会导致HBE细胞发生自噬及EMT。3-MA抑制自噬、EP预处理HBE细胞及沉默HMGB1均可抑制HBE细胞的EMT水平。