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目的:研究适于高危妊娠无创性早期诊断方法,探讨生物芯片技术在预防遗传性疾病、先天性感染性疾病的应用价值。
方法:
1、利用基因芯片在预防遗传性疾病的检测研究
(1)用酚氯仿法从孕妇外周血浆中提取游离DNA,通过PCR技术检测其SRY基因,对胎儿性别进行鉴定;
(2)选择实验中SRY基因阳性样本(即胎儿DNA),用基因芯片定量检测胎儿DNA,观察妊娠不同时期胎儿DNA浓度变化,比较正常和异常妊娠时胎儿DNA含量差异。
(3)从孕妇外周血浆游离胎儿DNA中提取APC基因,亚硫酸氢钠转化后,用基因芯片检测APC基因启动子区一组CpG位点甲基化状态,对不同妊娠时期及健康未孕样品进行分析比较。
2、利用蛋白芯片在预防先天感染性疾病的检测研究
(1)以玻片为基质,六种不同方法对玻片表面进行修饰,测量其接触角,对其表面采用原子力学显微镜进行表征;不同浓度孕妇血清中TORCH IgM点样于修饰后的玻片制备蛋白质微阵列,比较不同修饰方法对蛋白质的固定效率、检测线性范围和背景等;
(2)采用玻片表面修饰琼脂糖膜制备蛋白质微阵列,以生物素标记二抗,利用生物素和链霉亲和素强大亲和力,检测血清中TORCH IgM抗体;
(3)抗原点样于被琼脂糖膜修饰的玻片表面,纳米金标记抗体和微阵列孵育,银加强放大微阵列信号,肉眼观察或普通平板扫描仪记录结果。
结果:
1、利用基因芯片在预防遗传性疾病的检测研究
(1)68例中妊娠男性胎儿孕妇有66例血浆中出现SRY基因条带,总符合率97.0%。所有妊娠女性胎儿孕妇外周血浆中没有检测到目的条带。
(2)对正常妊娠孕妇外周血浆中胎儿DNA含量分析显示:胎儿DNA含量随着孕期的增长而增加。对异常妊娠孕妇外周血浆中胎儿EDNA含量分析显示:妊娠期高血压疾病的孕妇其胎儿DNA含量有明显升高,而唐氏高危的孕妇其胎儿DNA含量没有明显变化。
(3)在健康未孕妇女血浆中APC基因是低甲基化或未甲基化,而在妊娠状态下是高甲基化;在不同妊娠时期甲基化程度不同;产后样品中APC基因甲基化消失迅速,方差分析表明其与未孕样品之间差异无显著性(P>0.01)。
2、利用蛋白芯片在预防先天感染性疾病的检测研究
(1)测量修饰后玻片接触角,对玻片表面进行表征,对蛋白质固定效率、效果综合分析,琼脂糖修饰玻片表面接触角较大,表面有多孔结构,有一定厚度,结合蛋白质分子能力最大,其点的变异度小,没有拖尾现象。
(2)以荧光为检测信号,基于生物素-链霉亲和素系统制备的TORCH感染检测蛋白质微阵列,IgM最低检出量为0.5ng,蛋白质微阵列和ELISA法同时对CMV、RV、TOX和HSV Ⅱ IgM抗体总的检测诊断符合率为97.1%。
(3)采用免疫金银染色法制备的TORCH感染检测蛋白质微阵列,IgM最低检出量为12.5ng,微阵列和ELISA法同时对CMV、RV、TOX和HSV Ⅱ IgM抗体总的检测诊断符合率为93.3%。
结论:
1、孕妇外周血浆中胎儿DNA含量的变化可以指导产前诊断;
2、孕妇外周血浆中APC甲基化模式的变化与妊娠状态和时间均有一定的关系;不同妊娠时期,孕妇外周血浆中APC基因甲基化程度不同:
3、基因芯片高通量检测胎儿DNA含量及基因启动子区多个甲基化位点的甲基化模式,孕妇外周血浆中DNA甲基化作为一种新的产前诊断标志,必定为无创性产前诊断真正应用于临床发挥重要作用;
4、琼脂糖修饰玻片是一种理想的制备蛋白质微阵列的表面修饰方法;
5、分别采用荧光和免疫纳米金为检测信号制备的TORCH感染检测蛋白质微阵列,具有高信息通量、制备与检测快速简单的优点,展示了良好的应用前景。