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前列腺癌是一种威胁男性健康的重大疾病,雄激素受体(Androgen Receptor,AR)信号通路在前列腺癌的发生与演进过程中发挥重要作用,因此,临床上通过手术或药物抑制AR信号通路是治疗早期前列腺癌的标准方法。但是雄激素剥夺只能在一段时间内延长患者的生存期,多数患者会在2年内发生癌症复发,发展为浸润性更强的去势抵抗性前列腺癌(Castration Resistant Prostate Cancer,CRPC)。目前的研究结果显示,去势抵抗的形成来源于AR信号通路被重新激活。基于此,已经有多种新型阻断AR信号通路的药物用于临床。雷公藤红素是从传统中药雷公藤根部分离的三萜烯类化合物,其化学结构与第三代AR信号通路阻断剂TOK-001相似,作用于AR降解途径,对CRPC的治疗具有潜在的应用效果。研究表明,抑制AR信号通路诱导细胞自噬。本研究首先分析了雷公藤红素抑制AR信号通路对细胞自噬的诱导。q PCR显示雷公藤红素诱导ATG5和ATG7基因表达上调;共聚焦显微镜观察发现雷公藤红素作用后自噬体与自噬斑数量增多;免疫印迹结果显示雷公藤红素处理后自噬标志物LC3-II/LC3-I比值升高,且自噬体受体蛋白p62表达降低,表明雷公藤红素诱导细胞自噬的发生,并促进自噬潮的进行。在雷公藤红素诱导细胞自噬过程中,伴随着AR蛋白的降低,提示AR负调控雷公藤红素诱导的细胞自噬。为进一步探究AR和雷公藤红素诱导的细胞自噬的关系,本研究通过RNAi技术沉默AR,结果显示AR沉默后细胞自噬水平升高;相反,过表达AR或通过R1881激活内源性AR则抑制基础水平以及雷公藤红素诱导的细胞自噬。这些结果表明,AR负调控雷公藤红素诱导的细胞自噬。抑制AR信号通路将诱导细胞凋亡,而凋亡间接地诱导自噬的发生。为分析凋亡的间接影响,我们利用雄激素阻断剂MDV3100抑制AR信号通路,证实在未发生凋亡的条件下,AR与自噬呈负相关。同样,雷公藤红素在不影响凋亡的条件下降低AR,导致细胞自噬。通过抑制剂处理进一步发现,凋亡被抑制不影响雷公藤红素诱导的细胞自噬;而自噬被抑制则促进细胞凋亡。AR作为转录因子既可以调控功能基因的转录,也可以调控非编码基因的转录。通过miRNA表达谱分析发现,雷公藤红素诱导自噬过程中miR-101以及miR-17-92a基因簇的表达显著下调,该结果通过q PCR得以验证。鉴于miR-101以及miR-17-92a基因簇的启动子区可以预测雄激素反应元件(ARE),我们推测AR转录激活这两个miRNAs抑制自噬。通过双荧光素酶报告基因分析以及染色质免疫沉淀证明AR能够与miR-101和miR-17-92a基因簇预测的ARE结合。在前列腺癌细胞系,miR-101和miR-17-92a基因簇的表达与AR表达水平呈正相关。在AR阳性细胞沉默AR基因造成miR-101和miR-17-92a基因簇的表达下调;在AR阴性细胞过表达AR基因造成二者表达上调。这些结果进一步证实AR转录激活miR-101和miR-17-92a基因簇。miR-101为自噬抑制剂。雷公藤红素降低AR,解除了其对自噬的抑制,但转染miR-101类似物可以弥补AR对自噬的抑制作用;过表达AR增强对自噬的抑制,但miR-101抑制剂共转染可以逆转AR高表达对自噬的抑制效应,表明miR-101是AR抑制雷公藤红素诱导的细胞自噬的一个效应分子。miR-17-92a基因簇与细胞自噬的调控关系未见报道,本研究通过蛋白免疫印迹实验和共聚焦显微镜观察,确认miR-17-92a基因簇抑制基础水平以及雷公藤红素诱导的细胞自噬。通过构建miR-17-92a基因簇的截短体,解析miR-17-92a基因簇成员分子与细胞自噬的关系,结果显示在基因簇中miR-17和miR-20a能够抑制基础水平以及雷公藤红素诱导的细胞自噬;而miR-18a则激活雷公藤红素诱导的细胞自噬。通过双荧光素酶报告实验、q PCR以及免疫印迹杂交对miR-17和miR-20a靶基因进行验证,确认ATG7是miR-17和miR-20a的下游调控基因。通过转染缺少3￠UTR的ATG7的表达载体进行细胞自噬恢复实验,结果进一步明确miR-17和miR-20a通过调控ATG7抑制雷公藤红素诱导的细胞自噬。为了明确雷公藤红素诱导自噬在前列腺癌中的作用,本研究进行了MTT以及克隆形成实验,结果显示细胞自噬被miR-101、miR-17、miR-20a以及巴弗洛霉素抑制后,活细胞数以及细胞的克隆形成能力均下降,表明雷公藤红素诱导的细胞自噬对前列腺癌细胞的存活具有保护效应。综上所述,本研究揭示了AR对细胞自噬的负调控作用,阐明了雷公藤红素通过抑制AR,降低自噬抑制因子miR-101以及miR-17-92a基因簇的表达进而诱导细胞自噬。通过自噬抑制剂或miR-101以及miR-17-92a基因簇抑制自噬,可以提高前列腺癌细胞对雷公藤红素的反应,表明自噬对肿瘤细胞生存具有保护作用。