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目的:通过构建结合磷脂酰丝氨酸和氧化脂蛋白的清道夫受体(SR-PSOX)与6个组氨酸(His)融合基因慢病毒表达载体,诱导其表达,为研究SR-PSOX在动脉粥样硬化(AS)中的作用提供技术平台,探讨该基因是否通过TNF-α而参与AS的形成过程。方法:从新鲜人鼻咽癌组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获得SR-PSOX全外显子片段,通过TOPO酶快速连接pLenti6/V5慢病毒穿梭质粒中,转化TOP10 E.coli大肠杆菌,经抗生素筛选,挑选阳性克隆,提取质粒后通过PCR扩增和测序鉴定重组载体。将SR-PSOX -pLenti6/V5 TOPO质粒转化DH5α感受菌,以IPTG诱导SR-PSOX的表达;在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装质粒混合物与SR-PSOX -pLenti6/V5 TOPO共转染病毒包装细胞293FT,48h后,收集病毒上清,浓缩,鉴定;通过加入转染后的病毒包装细胞293FT的培养基上清液来刺激平滑肌细胞(SMC) blasticidin抗性细胞集落的形成,以确定病毒滴度;同时收获的病毒液加入SMC细胞培养基中,刮取细胞,裂解,收获蛋白,BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度;经SDS-PAGE分析SR-PSOX重组蛋白的产量,用蛋白印迹杂交(Western Blot)鉴定重组SR-PSOX。将oxLDL加入巨噬细胞、肝癌细胞HepG2培养基中,形成巨噬细胞源性及肝细胞源性的泡沫细胞模型,用间接免疫荧光法分别检测SR-PSOX蛋白的表达。将oxLDL加入稳定转染了SR-PSOX-pLenti6/V5 TOPO质粒的SMC培养基中,形成平滑肌源性的泡沫细胞模型,于12h、24h、36h、48h、72h收获细胞,加入细胞裂解液,以蛋白质印迹法分别检测SR-PSOX、TNF-α、β-actin蛋白各时段表达变化。结果:①DNA测序分析证实RT-PCR获得的SR-PSOX产物与GenBank中的数据完全吻合; SR-PSOX -pLenti6/V5 TOPO重组体阅读框无移码及碱基突变。②蛋白印迹法证实SR-PSOX -pLenti6/V5 TOPO重组体能够在原核系统中正确表达;重组人SR-PSOX基因经慢病毒293FT细胞内的包装后,可在SMC中较为稳定的表达。③经间接免疫荧光法及蛋白免疫印迹法检测,oxLDL孵育THP-1及HepG2细胞后,内源性SR-PSOX蛋白表达明显增强;oxLDL与重组SR-PSOX慢病毒共孵育的平滑肌细胞较单独oxLDL孵育的平滑肌细胞中SR-PSOX蛋白的表达量大且持久;且用油红O染色发现oxLDL与重组SR-PSOX慢病毒共孵育的平滑肌细胞比相应时段的oxLDL单独孵育的平滑肌细胞泡沫化加剧,细胞内脂滴蓄积明显增多、变大。④蛋白印迹法检测显示正常平滑肌中TNF-α不表达,稳定转染重组SR-PSOX慢病毒的平滑肌细胞中TNF-α有表达,且oxLDL与重组SR-PSOX慢病毒共孵育的平滑肌细胞TNF-α蛋白表达显著升高。结论:①利用lentiviral表达体系,可在细胞内准确地表达SR-PSOX;②oxLDL可刺激SMC、巨噬细胞、肝癌细胞HepG2内源性SR-PSOX蛋白表达增强;③SR-PSOX可促进泡沫细胞形成及促使细胞因子TNF-α表达上调;提示该基因可能通过上调TNF-α蛋白表达而促进动脉粥样硬化中炎症的发展与形成。