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幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是微需氧革兰氏阴性螺杆菌。1983年,澳大利亚科学家J Robin Warren和Barry J Marshall首先发现了幽门螺杆菌,并且证实慢性胃炎和消化性溃疡是由Hp感染所致,他们因为这一卓越的发现荣膺2005年诺贝尔生理学医学奖。幽门螺杆菌是世界范围内感染率最高的病原菌,全球人口感染率超过50%,它是慢性胃炎和消化性溃疡的罪魁祸首,并与胃腺癌、胃粘膜相关性淋巴样组织淋巴瘤(gastric mucosal-associated lymphoid tissue lymphoma,MALT)的发生密切相关,1994年被世界卫生组织确定为Ⅰ类致癌物。怎样有效控制Hp感染,一直是国内外学者关注的一大难题。幽门螺杆菌的定植,伴随着胃粘膜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞的浸润,细菌诱导的免疫反应不仅不能阻止细菌的定植,相反导致慢性胃部炎症,粘膜损伤程度与中性粒细胞浸润程度密切相关。幽门螺杆菌两种主要的毒力因子是空泡毒素(vacuolating cytotoxin A,VacA)和中性粒细胞激活蛋白(HP neutrophil-activiting protein,HP-NAP)。中性粒细胞激活蛋白HP-NAP由napA基因编码,分子量150kDa,是由4螺旋结构单体构成的十二聚体蛋白,对中性粒细胞、单核细胞有趋化作用,导致中性粒细胞浸润胃粘膜,并诱导中性粒细胞NADPH氧化酶激活,产生活性氧中间产物ROI(reactive oxygen intermediates,ROI),引起粘膜炎症和组织损伤。此外,HP-NAP能诱导中性白细胞和单核细胞表达β2整合素,以介导白细胞的粘附及吞噬作用,并介导免疫细胞间及免疫细胞与上皮细胞间的粘附作用;HP-NAP还能促进单核细胞中组织因子合成和2型纤维蛋白溶酶原激活抑制分子的分泌;HP-NAP通过MAPK途径激活中性粒细胞并激活肥大细胞脱颗粒和释放前炎症细胞因子IL-6;该蛋白中空可储存铁,其结构类似大肠杆菌DNA结合蛋白Dps。最近研究发现,HP-NAP能促进Th1免疫反应,在感染位点形成以IL-12、IL6、IL8、TNF-a增高的Th1型细胞因子环境,影响感染的结局。HP-NAP抗原性强,大多数HP感染病人产生NAP抗体,用HP-NAP免疫小鼠能保护机体抵抗Hp的感染,保护率80%。表明HP-NAP可作为Hp多成分疫苗的候选抗原。在HP-NAP的致病机理研究方面,由于它能激活中性粒细胞产生活性氧中间产物ROI,ROI能直接攻击DNA而具致突变作用,提示ROI可能是致突变因子,与Hp相关性胃癌的发生有关。目前,人们对HP-NAP与Hp相关性胃癌之间的关系知之甚少,弄清它们之间的关系对Hp相关性胃癌的诊断和治疗具有十分重要的意义。已知HP水溶性粗提物可上调中性粒细胞CXC趋化因子IL-8基因和生长相关癌基因GROa的mRNA和蛋白表达,IL-8是致炎症因子,GROa促进新生血管生成,与癌症的产生有关。NAP是否通过上调胃上皮细胞IL-8和GROa的表达发挥其致炎症和致肿瘤作用,目前尚不清楚。在Hp感染的治疗方面,目前国内外常用三联药物(如铋剂+甲硝唑+抗生素)治疗慢性胃炎和消化性溃疡。但是,Hp容易产生耐药性,导致抗生素治疗失效。如果Hp未能根除,多达75-80%的患者很快又旧病复发。有学者认为,病人口腔中存在Hp,可源源不断地向胃内供应病菌,是导致感染复发的另一重要原因。此外,抗生素可引起菌群失调等毒副作用。鉴于抗生素疗法不甚理想,疫苗被认为是控制Hp感染最有效的方法。目前Hp苗研究的热点主要集中在尿素酶(Ure)、毒力因子CagA、VacA和热休克蛋白60(HSP60)等亚单位保护性抗原上。但尿素酶难以诱导出全面而稳定的保护性免疫应答;CagA和VacA变异较大;HSP60和人体自身蛋白有比较高的同源性,用HSP60免疫小鼠只能获得局部保护性免疫应答,并且会导致小鼠肠胃炎,其作为疫苗的安全性和有效性尚需进一步验证。因此,迫切需要寻找新的合适的Hp疫苗候选抗原,深入探讨其免疫机理,为Hp疫苗的发展提供理论基础。多项实验证明,HP-NAP是疫苗研究的重要候选抗原,在HP-NAP抗原表位的研究方面,国内外尚未见报道。在本项研究中,我们首先构建了原核表达系统,体外克隆和表达了幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白HP-NAP。在此基础上,应用生物信息学、分子生物学、免疫学和生物化学等方法和技术着重从以下三个方面对HP-NAP的致病和免疫机理进行了初步的探讨。一、幽门螺杆菌NAP抗体水平与胃癌的相关性及致病机理初探应用PCR技术检测了Hp临床菌株中napA基因存在状况;应用重组的NAP蛋白,采用ELISA方法检测82例胃癌患者血清中NAP抗体含量,并与慢性胃炎和消化性溃疡、正常人群血清中NAP抗体含量进行比较,同时分析NAP抗体产生与患者年龄的关系。本研究还采用不同浓度的HP-NAP刺激SGC7901胃上皮细胞,测定细胞上清液中IL-8和癌细胞生长因子GRO-α浓度的变化,对HP-NAP与胃上皮细胞的相互作用进行了初步探讨。实验结果发现:所有Hp临床菌株中都存在napA基因,正常人血清中NAP抗体阳性率为42.6%,而HPIgG抗体的阳性率为55%,与我国人群中Hp感染率相似。HP-NAP抗体的阳性率略低于HPIgG抗体的结果表明,虽然所有Hp临床菌株均存在napA基因,但不同菌株NAP蛋白的表达有差异,与文献报道一致。胃癌患者血清HP-NAP抗体阳性率为97.5%,高于胃溃疡92.9%和慢性胃炎患者85.7%的抗体阳性率;胃癌患者NAP抗体水平显著性高于胃炎患者,但与胃溃疡患者无差异,表明NAP蛋白与胃癌的发生有一定相关性,NAP可能是胃癌发生的危险因子。NAP抗体水平与患者年龄无明显相关性。而且,NAP仅有轻微的刺激SGC7901胃上皮细胞株产生IL-8的作用,不能刺激SGC7901细胞产生GRO-α,说明NAP对胃上皮细胞的直接刺激作用十分有限,它主要通过激活中性粒细胞发挥其致炎症或致肿瘤的作用。二、HP-NAP单克隆抗体的制备、鉴定及临床意义以天然的Hp全菌蛋白为抗原制备单克隆抗体,并用原核表达的重组HP-NAP蛋白鉴定筛选针对HP-NAP的抗体,对获得的3株抗体进行亚类鉴定、效价、特异性、临床应用等鉴定,结果获得3株抗NAP蛋白的单抗,在Westernblot实验中,能与相应的重组蛋白发生反应。抗NAP单抗与其它肠道杆菌无交叉反应。免疫组化鉴定发现,3株NAP单抗能与Hp临床菌株发生反应;E019单抗可以与Hp感染胃癌患者胃粘膜上的Hp特异性结合。在单抗鉴定过程中,我们建立了用抗HP-NAP单克隆抗体检测胃活检标本的免疫组化方法,可以用来比较胃炎、胃溃疡和胃癌患者NAP蛋白的阳性率,进一步探讨NAP蛋白与胃癌的相关性。在免疫组化实验中,我们发现HP-NAP单克隆抗体E019与HP感染胃癌组织发生强阳性反应,但与胃炎组织的反应较弱,不显色或微弱显色,尚需加大例数作进一步探讨。而且,通过制备NAP单抗,可以建立更加特异和简便的诊断方法,用于Hp感染的诊断和预后的判断。还可应用鉴定出的NAP单抗作为靶分子,利用噬菌体肽库技术筛选NAP具有免疫原性的抗原表位,用于Hp多表位疫苗的研究。三、NAP生物信息学分析和B细胞抗原表位作图首先,应用生物信息学技术,对HP-NAP的三维结构和napA基因的ORF进行了分析,由Linux操作系统预测的三维结构显示有多个a螺旋,提示HP-NAP中存在跨膜结构,该蛋白是外膜蛋白;DNAMAN对napA基因的ORF分析显示,它有两个正向ORF和一个反向ORF,表明napA有许多不同的转录产物。接下来,依据HP-NAP的氨基酸序列,用DNAstar和EMBOSS在二级结构预测、亲水性和抗原性指数分析的基础上,进行B细胞抗原表位预测,发现有4个高抗原性肽段位于4-24,55-77,95-103和118-140氨基酸处,平均抗原性指数为1.0236,位于55-77氨基酸抗原性指数高达1.15并含有一个β转角。然后,用抗HP-NAP单克隆抗体E019作为靶分子,对噬菌体随机7肽库分别进行3轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选,对获得的阳性噬菌体克隆进行筛选和鉴定,从筛选得到的阳性克隆菌株提取单链DNA,进行测序和分析,获得模拟的B细胞表位,结果获得3个模拟的B细胞表位XVXFXKV,LXHXPXX和XQKSHTV,分别位于14-20,60-66及131-137氨基酸处。而且,肽库筛选获得的抗原表位分别位于预测的4-24,55-77,118-140氨基酸处的高抗原性肽段中。结果说明生物信息学是蛋白质抗原分析的良好工具,抗原表位能通过噬菌体展示肽库筛选而获得。本研究为Hp感染的免疫蛋白组学研究及疫苗研究提供了重要的信息。