水稻种子休眠与萌发主效QTL的鉴定与功能分析

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种子休眠不仅影响种子发芽和幼苗形态建成,而且影响产量和品质。目前水稻种子休眠和萌发的遗传调控机制仍不清楚。本研究使用来源于粳稻日本晴(Nipponbare,NIP)和籼稻9311衍生的导入系和回交自交系2套群体对种子休眠性的遗传位点进行连锁定位分析,同时采用包含252份水稻品种的自然群体对种子休眠位点进行全基因组关联分析。利用3套群体检测到多个影响种子休眠的数量性状位点(Quantitative trait locus,QTL),并鉴定克隆1个控制休眠的主效基因。主要结果如下:1.使用RICE6K芯片对122份9311/NIP导入系(CSSLs,Chromosome segment substitution lines)进行基因型分析,共获得3383个高质量SNPs。在此基础上构建了CSSLs的Bin图谱,该图谱共由387个Bins组成,Bin区间平均大小为800 kb。利用简化基因组测序鉴定400份9311/NIP回交自交系(BILs,Backcross inbred lines,BILs)的基因型,共获得49,890个高质量SNPs,构建了包含3,235个Bins的物理和遗传连锁图谱。Bin的大小分布于30 kb至3.0Mb之间,平均大小为115 kb。2.考察CSSLs和BILs种子的4个发芽参数,结合Bin基因型,使用岭回归方法检测种子休眠和萌发位点。在CSSLs群体中检测到12个影响休眠的QTLs,BILs群体鉴定到27个QTLs。其中8个位点在CSSLs和BILs中均定位到,4个重要休眠位点同时影响4个发芽参数。3.3.1和3.5是CSSLs和BILs中遗传效应最大的两个位点。3.1和3.5的NIP等位基因增加休眠性。近等基因系衍生分离群体分析验证3.1和3.5是影响休眠的主效位点。它们存在上位性互作,协同增加种子休眠性。含NIP来源的3.1和3.5的近等基因系种子对ABA敏感。4.利用RICE50K芯片对252份水稻核心种质进行基因型分析,共获得43,386个高质量SNPs。分析发现,连锁不平衡衰减距离在252份核心种质及其粳稻和籼稻两个亚群中分别约为130 kb、250 kb和200 kb。全基因组关联分析4个发芽参数共检测到22个休眠位点。第3染色体28 Mb附近的DOM3.5效应最大,与CSSLs和BILs中的3.5定位于相同区间。利用NIP和籼稻珍汕97B构建的CSSL衍生出的分离群体,通过F2初定位、重组交换单株筛选和F2:3家系表型分析,将DOM3.5精细定位至38 kb的区间内。双亲序列和基因表达信息分析表明,LOCOs03g49400可能是DOM3.5的候选基因。5.转基因互补试验表明LOCOs03g49400控制种子休眠,该基因编码一个乙烯不敏感蛋白,与拟南芥ethylene insensitive gene 2同源,将其命名为Seed Dormancy and Germination 3(OsSDG3)。利用CRISPR/Cas9技术敲除NILNIP中的OsSDG3。CRISPR敲除OsSDG3的突变体的种子发芽率和发芽整齐度较野生型均显著提高,说明OsSDG3NIP具有增加休眠的作用。RNAi抑制NIP中的OsSDG3,降低种子的休眠水平,表明OsSDG3在转录水平正调控种子休眠。6.在核心种质中OsSDG3有8种单倍型,各单倍型之间的种子休眠性存在显著差异。OsSDG3SNP122A互补转化热带粳稻AZUCENA(含OsSDG3SNP122C)能显著增强休眠,表明编码区的SNP(+122A>C)是影响休眠的功能位点。7.不同单倍型的OsSDG3近等基因系种子休眠性存在显著差异。近等基因系NIL-OsSDG3ZS97种胚内ACC含量较NIL-OsSDG3NIP显著升高,ABA含量降低。OsSDG3NIP较OsSDG3ZS97显著诱导种胚内ABA合成和传导信号等关键基因的上调表达。OsSDG3可能通过乙烯和ABA共同调控种子休眠和萌发。
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