论文部分内容阅读
滋养细胞是母胎界面进行物质交换的主要场所,是构成胎盘的主要成分。在妊娠早期,胎盘氧分压处于较低水平,妊娠8~13周时,随着滋养细胞侵袭能力增强,子宫螺旋动脉发生重塑,绒毛间氧分压增加,以此维持滋养细胞正常着床。若胎盘持续处于低氧状态,滋养细胞的增殖、分化和凋亡等将会发生异常改变,多种妊娠期疾病,如子痫前期(Preeclampsia,PE)和胎儿生长受限(Fetal growth restriction,FGR)等,发生胎盘滋养细胞侵袭过浅,血流灌注受限,胎盘浅着床,并引发滋养细胞过度凋亡,严重影响妊娠结局。生殖器形成抑制基因-1(Suppressor with morphogenetic effect on genitalia-1,SMG-1)属于PI3K相关激酶(Phosphoinositide 3-kinase-related kinase,PIKK)家族,是一种丝氨酸苏氨酸激酶。SMG-l基因编码含有3031个氨基酸残基的蛋白,该蛋白包含一个保守的激酶结构域、一个PIK相关激酶特有的C-末端结构域以及FK506结合蛋白12-雷帕霉素复合物的结合位点结构域。最初研究者认为其参与无义介导的m RNA降解(Non-sense m RNA decay,NMD)途径。随着研究深入发现SMG-1参与细胞内缺氧和DNA损伤等应激反应,可调控细胞增殖和凋亡等多项生理功能,并对抑制肿瘤的发生和发展具有一定潜在作用。信号转导子和转录激活子3(Signal transducer and activator of transcription 3,Stat3)是细胞内一种重要的转录因子,Stat3的C-端包含一个705位点的酪氨酸残基(Try Y705),其被酪氨酸激酶激活时,如JAK和Scr,Stat3将会沿着酪氨酸级联反应发生磷酸化;此外,Stat3的C-端还有一个727位点的丝氨酸残基(Ser727),由丝氨酸激酶激活,如m TOR、蛋白激酶C和CDK5,以此来最大化激活下游的转录基因。激活的磷酸化Stat3(p-Stat3)可调控机体细胞生理活动的基因转录,如细胞增殖、炎症、侵袭和凋亡等,p-Stat3在某些病理状态下发生异常表达,如肿瘤和子痫前期。人们还发现Stat3在许多缺氧细胞模型以及动物模型中参与细胞功能的调控。人们常将滋养细胞来源的细胞系作为研究滋养细胞功能的细胞模型。JAR细胞来源于滋养细胞系,为人类绒毛膜癌的转化细胞,是研究滋养细胞功能的细胞模型之一。由于胎盘原代滋养细胞一般取自足月产的胎盘或早孕期的流产胎盘,此时滋养细胞数量有限,体外生长增殖能力低下,在普通培养基中不易贴壁生长,难以达到实验研究需求细胞的稳定状态,故国内外通常选取人绒癌系细胞来作为研究对象。目的本研究采用流式细胞术、荧光定量PCR和蛋白印迹等方法,检测SMG-1在常氧条件和/或缺氧条件下对绒癌JAR细胞系凋亡水平和Stat3、p-Stat3表达水平的影响,初步探讨SMG-1在正常和/或缺氧环境中与JAR细胞凋亡之间的关系。材料和方法1研究对象绒癌JAR细胞系(ATCC,HTB-144)购自北京鼎国昌盛生物科技公司,使用DMEM-H、10%FBS、100 U/m L青霉素、100U/m L链霉素的完全培养基(Genview,美国),培养于37℃、5%CO2的培养箱。2方法将JAR细胞接种于六孔细胞培养板,生长融合至70%时,在常氧条件(37℃、5%CO2,95%空气)下和采用Co Cl2建立JAR细胞缺氧条件下,进行以下分组:(1)常氧条件分组:转染SMG-1 si RNA组、转染si RNA空载质粒(阴性对照组)和空白对照组;(2)缺氧条件分组:正常组和缺氧处理组。采用流式细胞术检测细胞凋亡水平;采用荧光定量PCR实验(Real time-PCR)和免疫印迹实验(Western Blot)检测细胞中SMG-1、Stat3的m RNA表达水平以及SMG-1、Stat3和p-Stat3蛋白的表达水平。3统计学处理用SPSS17.0软件进行统计学分析,数据以`x±s表示,荧光定量PCR实验结果利用2-ΔΔCT方法分析,多组数据分析时采用单因素方差分析,两组数据分析时运用配对设计定量资料的t检验。以α=0.05作为检验标准。结果1常氧条件下SMG-1对JAR细胞凋亡率的影响在常氧条件(37℃,5%CO2,95%空气)下,通过瞬时转染SMG-1的si RNA沉默SMG-1的表达后,利用流式细胞术检测细胞凋亡结果显示,SMG-1的si RNA转染组细胞凋亡率为(14.69±2.641)%,空白对照组为(5.43±1.043)%,阴性对照组为(7.26±1.214)%。与空白对照组和阴性对照组相比,转染组细胞凋亡率增加,差异具有统计学意义(P<0.05),而阴性对照组与空白对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。即抑制SMG-1的表达后,JAR细胞凋亡水平增加。2常氧条件下SMG-1对JAR细胞Stat3 m RNA的表达影响在常氧条件下,通过瞬时转染SMG-1的si RNA沉默SMG-1的表达后,利用荧光定量PCR检测SMG-1和Stat3的m RNA表达水平结果显示,转染组SMG-1的m RNA相对表达水平为0.430±0.040,阴性对照组的SMG-1的m RNA相对表达水平为0.949±0.047。与空白对照组相比,转染组SMG-1的m RNA相对表达水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05);转染组的Stat3的m RNA相对表达水平为0.667±0.069,阴性对照组为1.083±0.147,与空白对照组和阴性对照组相比,转染组的Stat3的m RNA相对表达水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。即抑制SMG-1的表达后,JAR细胞Stat3 m RNA的相对表达水平降低。3常氧条件下SMG-1对JAR细胞Stat3和p-Stat3蛋白的表达影响在常氧条件下,通过瞬时转染SMG-1的si RNA沉默SMG-1的表达后,利用Western Blot检测Stat3和p-Stat3的蛋白表达水平结果显示,转染组Stat3的蛋白表达水平为1.056±0.022,阴性对照组为1.872±0.036,空白对照组为1.789±0.046,与阴性对照组和空白对照组相比,转染组Stat3的蛋白表达水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05);转染组p-Stat3的蛋白表达水平为0.157±0.026,空白对照组为0.430±0.010,阴性对照组为0.326±0.043,与空白对照组和阴性对照组相比,转染组p-Stat3的蛋白表达水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。即抑制SMG-1的表达后,JAR细胞Stat3和p-Stat3的蛋白相对表达水平均降低。4缺氧条件下JAR细胞凋亡率的表达情况通过Co Cl2使JAR细胞缺氧后,利用流式细胞术检测细胞凋亡水平结果显示,缺氧处理组的细胞凋亡率为(17.83±2.041)%,与对照组(4.02±1.242)%相比,缺氧处理组的细胞凋亡率升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。即缺氧后JAR细胞凋亡水平增加。5缺氧条件下JAR细胞SMG-1和Stat3 m RNA的表达情况通过Co Cl2使JAR细胞缺氧后,利用荧光定量PCR检测SMG-1和Stat3的m RNA表达水平结果显示,缺氧处理组SMG-1的m RNA相对表达水平为3.569±0.264,与正常组相比,缺氧处理组SMG-1的m RNA相对表达水平增加,差异具有统计学意义(P<0.05);缺氧处理组Stat3的m RNA相对表达水平为1.699±0.243,高于正常组,差异具有统计学意义(P<0.05)。即缺氧后JAR细胞SMG-1和Stat3的m RNA相对表达水平均增加。6缺氧条件下JAR细胞SMG-1、Stat3和p-Stat3蛋白的表达情况通过Co Cl2使JAR细胞缺氧后,利用Western Blot检测SMG-1、Stat3和p-Stat3的蛋白表达水平结果显示,缺氧处理组SMG-1的蛋白水平为0.435±0.020,正常组为0.260±0.003,缺氧处理组与正常组相比,SMG-1的蛋白表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05);缺氧处理组Stat3的蛋白水平为1.274±0.024,p-Stat3的蛋白水平为0.822±0.065,与正常组相比表达降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。即缺氧后JAR细胞SMG-1的蛋白表达水平增加,而Stat3和p-Stat3的蛋白相对表达水平降低。结论缺氧对妊娠期滋养细胞凋亡的机制调控极为复杂,本课题组得出SMG-1和Stat3参与绒癌JAR细胞系缺氧机制调控,抑制SMG-1可下调Stat3和p-Stat3进而促进绒癌JAR细胞系凋亡发生。