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近年来,微生物对药物的抵抗力逐渐增加,引起了世界范围内的广泛关注。一方面,大多数传统药物（如抗生素）逐渐无法对病原菌进行抑制或灭杀。另一方面,抗菌药物的氧化也是一个非常重要的问题。现如今,大多数食品工业都在使用对人体健康不利或可能产生一定副作用的合成抗氧化剂,因此,制药公司和食品公司都在寻找从天然资源（如动植物）生产生物活性肽的替代方法。这种从天然资中生产的抗菌肽安全、低毒,同时还具有高特异性但是与亲本蛋白融合的抗菌肽是无活性的。因此,必须通过不同的方法,例如微生物发酵、化学水解和酶促水解法,将它们从亲本蛋白上分解下来。因为化学水解会在反应过程中破坏某些氨基酸,而微生物发酵会由于微生物活性的变化而产生无活性的肽。而酶促水解法则具有效率高、反应条件温和且不破坏氨基酸等优点,因此可被用于从蛋白质中分解得到生物活性肽。非洲巨型蜗牛（Achatina Fulica）是一种可用于食品的菜田害虫,其可在恶劣的环境条件下生存,并产生一种可以保护其身体免受各种感染性微生物的侵害的粘液或粘液,因此可以用于治愈轻伤。蜗牛粘液通常作为一种抗衰老成分在化妆品工业中使用,除此之外,由于粘液中含有多种具有生物活性的蛋白质,因此粘液还具有抗氧化和抗菌等生物活性。因此,越来越多的研究者集中于从蜗牛粘液中获得生物活性化合物。本次研究中,蜗牛的粘液中的蛋白质含量通过酚试剂法（the Lowry method）测定,而凯氏定氮法（the Kjeldahl method）则用于测定样品中的总氮含量。采用甲醛滴定法（the Formol titration method）测量样品中总氨基氮含量,有助于进一步确定水解程度。首先,通过三种酶水解蜗牛粘液蛋白溶液,生成蛋白水解物。酶解过程中,温度、p H、酶浓度等最优条件保持不变。根据水解程度观察水解过程,并在一定时间间隔后收集蛋白质水解产物。采用体外抗氧化方法评价不同水解蛋白的抗氧化活性。此外,对致病性革兰氏阳性和阴性细菌的水解蛋白活性进行了研究。主要研究内容如下:（1）首次采用酚试剂法、凯氏定氮法和甲醛滴定法测定蜗牛粘液中蛋白质含量。实验结果显示,酚试剂法测定蜗牛黏液蛋白质含量约为51.23%w/w,而凯氏定氮法通过硫酸消化蜗牛黏液,测定总氮含量约为0.16 g N/g。进而通过甲醛滴定法测定总氨基氮,其水解度由肽键水解数和肽键总数来计算。（2）采用三种酶对蜗牛粘液蛋白溶液进行水解,并分析其蛋白水解产物。首先,在60℃,p H 6.0和2%w/v磷酸盐缓冲液与酶的混合的最佳条件下,用木瓜蛋白酶水解蛋白质溶液。根据水解度（the degree of hydrolysis,DH）观察到水解的进程。当水解反应时间从0.5 h逐渐增加到4 h,DH也由4.2%升高至17.5%。而随着反应时间逐渐增加,在反应6 h后,DH增加至38.38%,而在8 h时,达到最高DH,为44.1%。其次,采用胃蛋白酶对样品进行水解,最适温度为37℃,p H 2.0的甘氨酸-HCl缓冲液,酶浓度为2%w/v。在水解反应初期0.5 h内,蜗牛蛋白溶液快速水解,其用DH为15%。随后,当反应时间在1-5 h内,DH由17.1%达到21.5%。同时,反应时间为6 h,该反应物最高DH为24.5%。最后,在温度为55℃,p H为8.5的甘氨酸-Na OH缓冲液中,采用0.5%w/v的碱性蛋白酶用于水解反应。在最初的10-30mins内,该酶水解速率非常高,DH能达到14.1%-26.3%,而当酶解时间为60-120mins,DH为28.01%-30.5%,该反应在180mins时检测到最高的DH为34.5%。（3）通过对木瓜蛋白酶（Pap-H 0.5,Pap-H 1,Pap-H 2,Pap-H 4,Pap-H 6和Pap-H 8）、胃蛋白酶（Pep-H 0.5,Pep-H 1 Pep-H 2,Pep-H 3,Pep-H 4,Pep-H 5和Pep-H 6）,碱性蛋白酶（Alc-H 10,Alc-H 20,Alc-H 30,Alc-H 60和Alc-H 120和Alc-H 180）水解产物对2,2-二苯基-1-吡啶基肼基（DPPH·）,2,2’-叠氮基双-3-乙基苯并噻唑啉-6-硫酸（ABTS·+）,铁离子的抗氧化能力（FRAP）的抵抗能力进行测定。DPPH自由基清除试验表明,Alc-H 180和Pap-H 8的最低IC50值分别为21.3 mg/m L和21.5 mg/m L,而Pep-H 6的C50值为30.5 mg/m L。ABTS·+的自由基清除结果表明,Alc-H 180,Pep-H 6和Pap-H 8可得到IC50值最低,分别为17.1mg/m L,19.1 mg/m L和27.9 mg/m L。FRAP分析结果显示,Pep-H 6具有最高的还原能力,为1.6 mmol/L。而在木瓜蛋白酶的水解物中,Pap-H 8具有很强的还原能力,为1.1 mmol/L时。碱性蛋白酶的水解产物Alc-H 180的还原能力为0.27 mmol/L。（4）通过微量稀释法评价了蛋白质水解物对革兰氏阴性菌大肠杆菌（Escherichia coli,A ATCC NO.8739）,铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,ATCC NO.27853）以及革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis,ATCC NO.14579）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,ATCC NO.6538）的抗菌能力。结果显示,碱性蛋白酶的水解产物（Alc-H 10,Alc-H 20,AlcH 30,Alc-H 60,Alc-H 120和Alc-H 180）表现出对两种革兰氏阴性细菌的抗菌能力（大肠杆菌和铜绿假单胞菌）。最小抑菌浓度（the minimum inhibitory concentration,MIC）是抑菌剂的最低浓度,为10000 ug/m L,可以确定细菌生长的抑制百分比。孵育8小时后,Alc-H 180对大肠杆菌和铜绿假单胞菌的抑制作用最强,分别为38.46%和66.66%。木瓜蛋白酶的水解产物（Pap-H 0.5,Pap-H 1,Pap-H 2,Pap-H 4,Pap-H 6和Pap-H 8）则具有抗革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌的活性,所有水解产物均显示MIC为2500mg/m L。在孵育4小时后,Pap-H 8水解产物显示出对枯草芽孢杆菌的抑制率为68.75%。胃蛋白酶衍生的水解产物（Pep-H 0.5,PepH 1,Pep-H 2,Pep-H 3,Pep-H 4,Pep-H 5和Pep-H 6）则对另一种革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌起到抑制左右。孵育8小时后,MIC为2500 ug/m L,表现出较强的抗药性,而Pep-H6表现出对金黄色葡萄球菌高达68.57%的抑制作用。综上所示,通过三种不同的酶（木瓜蛋白酶,胃蛋白酶和碱性蛋白酶）,对蜗牛的粘液蛋白进行水解,获得蛋白水解物。该方法通过不同时间间隔生产水解产物,所测得DH%也有不同程度的增加,并且当DH%增加时,蛋白水解物的生物活性也有所增加。而为了研究蛋白质水解物的生物活性,对水解物的抗氧化性和抗菌型也进行了测定。实验结果表明,高DH也表现出较强的生物活性。Pap-H 8,Pep-H 6和Alc-H 180都显示出较高的DH%。与蛋白质水解产物相比,对照样品没有显示出明显的活性。在碱性蛋白酶的水解产物中,Alc-H180具有更高的自由基清除能力,并同时表现出对两种革兰氏阴性细菌存在抑制作用。而Pep-H 6具有高还原能力,对革兰氏阳性菌显示出很强的抑制作用。木瓜蛋白酶的水解产物Pap-H 8对革兰氏阳性菌显示出明显的抑制作用。酶促水解是一种有效且有前途的技术,可以从亲本蛋白质分解生成蛋白质水解物或肽。同时,蛋白质水解产物Alc-H 180,Pep-H 6和Pap-H 8具有优异的抗氧化性和抗菌性。