【摘 要】
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为了克隆胡萝卜AFP基因的启动子,设计了一个简便、实用的启动子克隆方案——载体锚定PCR法:将用单一限制酶完全消化的胡萝卜基因组DNA与pBluescript载体连接,得到以限制酶为
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为了克隆胡萝卜AFP基因的启动子,设计了一个简便、实用的启动子克隆方案——载体锚定PCR法:将用单一限制酶完全消化的胡萝卜基因组DNA与pBluescript载体连接,得到以限制酶为标识的胡萝卜基因组文库,并以此为模板,利用GSP(基因组特异引物)和载体通用引物进行PCR扩增.为验证所克隆候选启动子的功能,构建了两个植物转化载体:pC1300p-afp和pC1381zpafp.利用包含了AFP基因及其候选启动子的pC1300p-afp转化烟草Nc82,转化植株经过PCR和Southern-blot鉴定,证实外源片段已经整合到烟草的基因组中.分别提取非冷诱导的和在4℃冷处理24小时的转基因烟草总RNA进行RT-PCR检测,结果都检测到了AFP基因的转录.最后,我们还将AFP基因连入含有单子叶植物强启动子Act1的植物转化载体上,构建了pC13Actafp,并用于转化一个不耐寒的水稻品种中花11.得到了抗潮霉素的转化水稻.PCR鉴定结果表明AFP基因已经转入了水稻.
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