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目的:近年来随着人口老龄化、经济发展和城市化,人们更多久坐不动的生活方式和与肥胖相关的不健康食品的摄入,糖尿病(diabetes mellitus,DM)的发病率和流行率在不断上升,成为阻碍健康和人类发展的主要威胁之一。其中,2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是最常见的糖尿病类型,约占所有糖尿病的90%,其主要发病机制是:胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)和胰岛素相对分泌不足。肝脏是胰岛素作用的重要靶器官之一,大约90%内源性葡萄糖产生的来源,在维持空腹内生葡萄糖的产生和输出,以及进食后葡萄糖的吸收、利用以及储存方面起重要作用。肝脏胰岛素抵抗是指胰岛素抑制肝脏葡萄糖输出的能力下降,主要涉及的病理生理特征是肝脏胰岛素信号通路异常,糖异生和糖原分解增加,从而导致肝糖输出增多。同时IR导致肝脏脂质沉积会进一步降低胰岛素敏感性,形成恶性循环。肝脏IR对整体T2DM的病理生理机制的贡献是显著的,尤其对空腹血糖和基础胰岛素水平影响很大,缓解肝脏IR的治疗方法对T2DM的治疗有着重要的作用。N1-甲基烟酰胺(N1-methylnicotinamide,MNAM)是烟酰胺(维生素B3的一种)甲基化后的产物,近来关于MNAM与代谢性疾病的关系备受关注。目前有动物和人群研究认为MNAM与T2DM胰岛素抵抗相关,但结论不一,机制不明。最新研究显示,MNAM干预降低了高脂饮食小鼠的空腹血糖和胰岛素,改善胰岛素敏感性,并发现MNAM干预小鼠肝脏去乙酰化酶沉默信息调节因子1(silent information regulation 2 homolog 1,SIRT1)蛋白表达升高。SIRT1是具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性的蛋白脱乙酰基酶,可以通过使多种控制代谢及内分泌信号的转录因子脱乙酰基而调节其活性,从而广泛参与调节糖脂代谢平衡、胰岛素分泌等多条代谢通路。本研究旨在探索MNAM对2型糖尿病肝脏胰岛素抵抗和糖代谢的影响,并对其可能的调节机制做进一步研究。研究方法:1、研究MNAM对ob/ob肥胖糖尿病小鼠糖代谢及胰岛素抵抗的影响:4周龄健康雄性ob/ob小鼠和C57BL6小鼠,经4周喂养后(小鼠8周龄),认定ob/ob小鼠2型糖尿病模型稳定,随机分为三组:ob/ob组,低剂量MNAM干预组(ob/ob+0.3%MNAM组),高剂量MNAM干预组(ob/ob+1%MNAM组);正常野生型C57BL6小鼠随机分为:对照组(WT组)和高剂量MNAM干预组(WT+1%MNAM组)。干预因素MNAM持续喂养小鼠8周,后进行腹腔注射葡萄糖耐量(IPGTT)及胰岛素释放试验。检测各组小鼠在各时间点的血糖及胰岛素,绘制曲线,并计算曲线下面积和胰岛素抵抗相关指标。2、研究MNAM对ob/ob肥胖糖尿病小鼠肝脏胰岛素敏感性的影响:通过HE、油红O及肝脏组织甘油三酯含量检测,观察MNAM干预对肝脏脂质沉积的影响;通过Real-time PCR和Western Blot方法检测糖异生关键酶PEPCK和G-6-Pase的mRNA表达,以及胰岛素信号通路关键分子IRS-2,PI3K,AKT和GSK3β蛋白表达及其磷酸化水平。3、研究MNAM调控肝脏胰岛素敏感性和糖代谢的潜在机制:应用Real-time PCR和Western Blot方法检测肝脏组织SIRT1、FOXO1和PGC-1α的mRNA和蛋白表达;应用人正常肝细胞LO2给予PA处理建立肝细胞胰岛素抵抗模型,应用MNAM处理后,测定培养基葡萄糖剩余量;检测糖异生关键酶和胰岛素信号通路关键分子的表达;并应用SIRT1抑制剂处理MNAM干预的IR肝细胞,验证SIRT1在MNAM影响肝细胞IR中的作用。结果:1、MNAM干预8周后,ob/ob+1%MNAM组小鼠体重和空腹血糖均明显低于ob/ob组(p<0.05);IPGTT结果显示,ob/ob+1%MNAM组小鼠空腹血糖下降,但葡萄糖刺激后各点血糖与ob/ob组无显著差异(p>0.05);胰岛素分泌水平提示MNAM干预各组空腹和整体胰岛素分泌水平低于ob/ob组(p<0.05);胰岛素抵抗相关指标计算可见MNAM干预各组HOMA-IR低于ob/ob组(p<0.05),QUICKI胰岛素敏感指数和松田指数高于ob/ob组(p<0.05)。2、肝脏病理组织学实验结果显示,与WT组相比,ob/ob组肝脏有明显脂肪变性和脂滴浸润,肝脏TG含量也明显升高(p<0.05),MNAM的干预可一定程度缓解上述情况;与对照组相比,ob/ob组小鼠肝组织中糖异生相关PEPCK、G-6-Pase的mRNA表达明显升高(p<0.05),而MNAM干预的两组小鼠上述基因表达明显低于ob/ob小鼠(p<0.05);在ob/ob组,肝脏p-IRS-2/IRS-2,p-PI3K/PI3K,p-AKT/AKT,p-GSK3β/GSK3β比值明显低于对照WT各组(p<0.05),而MNAM干预各组上述蛋白的磷酸化水平高于ob/ob组(p<0.05)。3、与对照组相比,ob/ob小鼠肝脏SIRT1的mRNA和蛋白表达下降,PGC-1α表达上调,FOXO1乙酰化水平升高(p<0.05),而1%MNAM的干预可以使ob/ob小鼠肝脏SIRT1的mRNA和蛋白表达升高,PGC-1α表达下降,FOXO1乙酰化水平下降(p<0.05);应用PA干预LO2细胞建立肝细胞IR模型,经MNAM处理后,测定培养基葡萄糖剩余量,发现胰岛素抵抗PA组培养基葡萄糖剩余量高于其他各组(p<0.05);PA组PEPCK和G-6-Pase的mRNA相对表达量较对照组和MNAM干预组明显升高(p<0.05);PA组IRS-2,PI3K,AKT和GSK3β的蛋白磷酸化水平明显低于对照组和MNAM干预组(<0.05);应用SIRT1抑制剂处理后,MNAM减少PA诱导的IR肝细胞糖异生的作用和调节IR肝细胞胰岛素信号通路的作用消失。结论:MNAM通过调节肝脏SIRT1、FOXO1和PGC-1α,而影响胰岛素信号通路传导和肝糖异生,减轻肝脏脂质沉积,从而调节肝脏胰岛素敏感性,减少肝糖输出,降低ob/ob肥胖糖尿病小鼠空腹血糖和体重,改善其胰岛素抵抗。