目的：本实验将EGF基因CDS片段亚克隆至腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-1，在体外重组至腺病毒载体pAd/BL-DEST，构建重组腺病毒载体，并转染HEK293细胞进行腺病毒包装，获得重组腺病毒rAd-EGF。将重组腺病毒rAd-EGF在体外感染指数生长期人牙髓干细胞，分析人牙髓干细胞被转染后EGF蛋白的表达情况，为后续实验提供材料及数据。方法：在体外用含有10%胎牛血清的DEME培养基传代培养人牙髓干细胞至第三代，镜下观察细胞贴壁及生长情况。双酶切pCR4-TOPO-EGF及腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-1，1%琼脂糖凝胶电泳检测后分别回收EGF片段的带和线状pYr-adshuttle-1载体带，连接转化感受态大肠杆菌DH5α，并进行扩增，提取重组质粒pYr-adshuttle-1-EGF，进行酶切鉴定。将鉴定正确的重组质粒采用体外同源重组将EGF表达框亚克隆至腺病毒表达载体pAd/PL-DEST，XbaI酶切重组腺病毒载体pAd-EGF，进行酶切鉴定。用PacI酶切pAd-EGF使重组腺病毒载体线性化后转染包装细胞HEK293，包装成重组腺病毒rAd-EGF，PCR鉴定并测定病毒滴度。感染前24h取指数生长期的人牙髓干细胞根据实验目的将其分为3组：重组腺病毒rAd-EGF感染组、对照腺病毒rAd-NC阴性对照组、空白对照组，当细胞密度达到70%时，感染组和阴性对照组加入100MOI重组腺病毒或对照腺病毒，空白组加等量DEME培养液，置于37℃、5%C02培养箱中培养4小时，更换培养基为含10%胎牛血清的DMEM，培养48h后胰酶消化收集各组细胞进行Western-blot，检测基因转染后各组EGF的蛋白表达差异。结果：人牙髓干细胞在镜下成梭形或多角形，2~3个不等突起，生长情况良好。 pYr-ads-1-EGF经KpnI、XhoI酶切鉴定分析表明腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-1-EGF构建成功。pAd-EGF进行XbaI酶切鉴定和测序鉴定，确定和目的序列一致，腺病毒载体pAd-EGF构建成功。经PCR鉴定，重组腺病毒rAd-EGF包装成功。重组腺病毒rAd-EGF感染DPSC细胞48h后，Western-blot检测各组EGF的蛋白表达，结果显示重组腺病毒rAd-EGF感染组的EGF的蛋白表达水平均显著高于其他两对照组(p<0.05)。结论：体外成功培养人牙髓干细胞至第三代，细胞生长良好，增殖情况正常。酶切鉴定表明成功构建了重组腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-1-EGF和重组腺病毒载体pAd-EGF后，采用HEK293细胞进行腺病毒包装，最终获得重组腺病毒rAd-EGF。采用重组腺病毒rAd-EGF成功转人牙髓干细胞后，高表达EGF蛋白。说明腺病毒是一种有效的转染载体，人牙髓干细胞是一种理想的基因载体细胞，腺病毒介导的EGF基因可有效转染人牙髓干细胞。