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人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)与猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus, SIV)同属于反转录病毒科慢病毒属,两者的亲缘关系很近。SHIV,即SIV/HIV嵌合病毒,是利用基因重组技术将SIV和HIV的相应基因进行置换而构建出来的重组嵌合病毒。目前,SHIV/恒河猴动物模型被广泛应用于AIDS的研究当中。衣壳蛋白p27是SHIV的主要抗原成分之一,也是制备抗p27单克隆抗体必需的免疫原,应用十分广泛。本文旨在利用基因工程的方法获得高纯度的p27抗原,制备抗p27单克隆抗体,用于探索构建检测p27抗原的诊断试剂盒。根据GenBank发表的人/猴免疫缺陷病毒SHIV89.6P全基因组序列设计合成一对引物(含有EcoR I和Xho I两个酶切位点),利用PCR技术从质粒SHIV89.6P中扩增p27gag基因,并克隆入pMD18-T载体,测序鉴定;将p27gag基因插入表达载体pET32a T7启动子下游,构成重组质粒pET32a-p27并使其在大肠杆菌BL21中高效表达。利用SDS-PAGE电泳观察外源基因表达条带大小是否与预期相符。利用固定化金属离子(Ni2+)配体亲和层析技术从表达蛋白中纯化目的蛋白,Western Blot检测。将纯化后的p27抗原免疫Balb/c小鼠。取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0,用PEG融合。经HAT、HT选择培养后,通过有限稀释法筛选出能产生p27抗体的杂交瘤细胞株。最后将扩大培养的杂交瘤细胞注入Balb/c小鼠腹腔,每只注射5×106个细胞使其产生腹水,制备单克隆抗体。本试验主要结果如下:1.将PCR产物进行电泳分析,获得与预期结果一致的大小为763bp的p27基因。2.对重组质粒T-p27与pET32a-p27分别进行双酶切和测序鉴定:双酶切结果正确,DNA序列分析结果表明p27基因片段未发生碱基突变或缺失,证明重组质粒已成功构建。3.重组质粒pET32a-p27转化大肠杆菌BL21,将IPTG小量诱导产物进行SDS-PAGE电泳分析,与空白对照pET-32a转化大肠杆菌BL21后经IPTG小量诱导的产物相对照,在分子量43Ku和66.2Ku之间可见一个明显的蛋白条带,与预期结果46Ku的p27抗原大小一致,表明重组质粒可以正确表达目的蛋白。对超声波破碎后离心所得的沉淀和上清进行SDS-PAGE电泳分析,证实目的蛋白多以可溶形式存在。4.经Ni2+亲和层析纯化后,证实目的蛋白的纯度可达90%以上,表明已获得纯度较高的目的蛋白。5.以纯化后的目的蛋白作为抗原进行单克隆单体制备,获得5株单抗,分别命名为1A5、1C7、3C2、2D12、3D12。应用间接免疫荧光技术(IFA)和蛋白免疫印迹技术(Western Blot)进行验证,结果表明所获得的单克隆抗体均具有良好的特异性。本研究成功的制备了5株能稳定分泌抗p27蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株,试验结果表明5株单抗均可进行体外病毒抗原的检测且结果良好,为进一步研制抗原检测试剂盒以及对艾滋病病毒的研究奠定了基础。