鸡白痢沙门菌是引起禽沙门菌病最主要的病原菌之一,疫苗接种是一种较好的防控方法,而基因缺失疫苗是未来疫苗的研究方向,利用基因工程的方法对毒力基因进行敲除,在减弱毒力的同时该菌株的免疫原性也不会受到影响,因此,研究开发遗传背景清晰的基因缺失减毒沙门菌活疫苗就显得意义重大且迫在眉睫。cya和crp是沙门菌两个主要的毒力调节基因,缺失crp基因的鸡白痢沙门菌已被证明毒力明显降低且免疫原性良好,但有关鸡白痢沙门菌ΔcrpΔcya双缺失株和Δcya单缺失株方面的研究目前尚未见报道。为此,本研究通过利用重组自杀性质粒介导的同源重组技术,在本实验室已构建的鸡白痢沙门菌C79-13 crp基因单缺失株的基础上进一步敲除cya基因,两步法筛选出双缺失株C79-13ΔcrpΔcya,同时构建了单缺失株C79-13Δcya,进而对C79-13ΔcrpΔcya、C79-13Δcrp、C79-13Δcya各缺失菌株进行了生物学特性和免疫学特性检测并分析比较,以为进一步研究Δcya缺失株的特性和筛选较为理想的鸡白痢沙门菌基因缺失候选疫苗株奠定基础。具体内容如下:1.鸡白痢沙门茵cya基因的克隆表达及生物信息学分析通过PCR技术获得鸡白痢沙门菌cya基因,并利用生物信息学相关软件进行系统性分析。结果显示,cya基因大小为1182 bp,由394个氨基酸编码组成,分子式为C2026H3146N562O578S11。Cya为膜内蛋白,无信号肽与跨膜区,有4个N-糖基化位点、1个O-糖基化位点、27个磷酸化位点、13个线性B细胞结合位点、11个T细胞结合位点。二级结构中Hh、Ee、Tt、Cc所占比例分别为38.07%、19.80%、5.58%和36.55%。将cya基因连接至原核表达载体p ET-32a构建重组表达质粒p ET-32a-cya,经IPTG诱导表达、纯化后经聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blot分析显示,在原核表达系统中主要以包涵体形式存在,蛋白分子质量大小约为58 ku。2.鸡白痢沙门菌crp/cya基因缺失株的构建及生物学特性比较分析以鸡白痢沙门菌C79-13基因组为模板,分别将cya上下游片段克隆至自杀性质粒p RE112,构建含缺失1182 bp的cya基因重组自杀性质粒p REΔcya;进而将构建成功的重组自杀性质粒PRE-cya转化至大肠杆菌χ7213中,并将此菌株作为供体菌,C79-13Δcrp为受体菌,通过同源重组的方法,两步法筛选出鸡白痢沙门菌ΔcrpΔcya双基因缺失株;同时以C79-13亲本菌为受体菌,同样的方法构建Δcya缺失菌株。再以亲本菌株和Δcrp缺失菌株为对照,分别对所构建的Δcya和ΔcrpΔcya缺失菌株的生物学特性进行检测。结果表明,缺失cya基因和缺失crp基因相似均不影响鸡白痢沙门菌的表型、血清型和主要生化特性;各缺失菌株的生长速度与亲本菌株相比均明显下降,其中ΔcrpΔcya双缺失株下降尤为明显,同时其生物被膜的形成能力也均显著降低（P＜0.01）;LD50检测结果显示,与C79-13亲本菌株相比,Δcya、Δcrp以及ΔcrpΔcya三个缺失株的毒力均明显降低,LD50分别为2.84×10~9 cfu/ml、1.41×1010 cfu/ml、2.51×1011cfu/ml。与亲本菌株相比,Δcya、Δcrp、ΔcrpΔcya缺失株的毒力分别降低约1.1×10~3、5.7×10~3倍、1.0×10~5倍。3.鸡白痢沙门菌crp/cya基因缺失株免疫学特性比较分析分别将Δcya、Δcrp和ΔcrpΔcya缺失株通过口服途径免疫7日龄实验鸡,14日龄时二免,同时设立PBS液空白对照组。在首次免疫后7d、14d、21d、28d、35d、42d时,各组随机抽取实验鸡相应样品,分别检测血清中特异性Ig G、主要细胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-4）和小肠粘膜中s Ig A水平的高低;在14d、21d、28d时检测淋巴细胞增殖情况;同时在二免后一周分别对各实验组鸡应用亲本菌株进行攻毒以检测各组的免疫保护率。结果显示,各缺失株免疫实验鸡后血清中Ig G抗体、IFN-γ、IL-2、IL-4含量、小肠粘膜中s Ig A抗体水平和淋巴细胞转化功能均明显高于对照组（P＜0.01）,说明各缺失菌株均可以诱导机体产生较好的体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫。三个缺失菌株中,C79-13Δcrp缺失株免疫组各指标的升高和增加更为明显,尤其与ΔcrpΔcya双缺失株相比许多指标在多个检测时间点差异明显（P＜0.01）。攻毒试验结果显示,C79-13Δcya、C79-13Δcrp、C79-13ΔcrpΔcya的免疫保护率分别为60%、80%、50%。表明缺失株C79-13Δcrp的免疫效果最好,有望作为一种鸡白痢沙门菌基因缺失疫苗的候选菌株。