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目的:为了将肺癌的靶向基因治疗和自体免疫增强疗法相结合,本研究扩增α-gal模拟表位序列和GPI锚定序列的融合基因,构建Survivin启动子调控的gal-GPI融合基因的真核表达质粒pSGFP-gal-GPI,并在细胞水平上研究重组质粒的表达功能以及血清天然anti-gal IgG与肺癌细胞表面特异性锚定表达的α-gal模拟表位的结合而介导的特异性杀瘤效应,为探索肺癌及其它肿瘤的基因治疗途径奠定基础。方法:1.分离人外周血淋巴细胞,提取总RNA,以RT-PCR法扩增CD24基因的243bp GPI锚定序列,双酶切后定向克隆入pSGFP质粒中,构建并鉴定pSGFP -GPI真核表达质粒。经脂质体介导转染A549细胞后,在荧光显微镜下观察EGFP-GPI融合蛋白在真核细胞内的表达及分布。2.PCR法扩增gal-GPI融合基因,以pSGFP质粒为载体,构建Survivin启动子调控的pSGFP-gal-GPI真核表达质粒。通过酶切及测序鉴定后,用脂质体将该质粒转染A549细胞,72h后提取总RNA,通过RT-PCR鉴定重组质粒在A549细胞中的转录水平。3.将pSGFP-gal-GPI用脂质体瞬时转染A549细胞后,用荧光显微镜观察GPI锚定表达功能,用免疫组化法和Western-blot法对锚定表达的α-gal模拟表位进行定位和免疫反应性分析,并用新鲜人血清对表达α-gal模拟表位的A549细胞进行补体介导的溶细胞效应研究。结果:1.经限制性内切酶酶切及DNA测序证实pSGFP-GPI真核表达质粒构建成功;将重组质粒及pSGFP分别转染A549细胞48h后,荧光显微镜观察pSGFP-GPI质粒转染A549细胞可见围绕细胞膜的强绿色荧光,而对照pSGFP质粒转染A549细胞仅见胞内均匀荧光。2.经限制性内切酶酶切及DNA测序证实pSGFP-gal-GPI真核表达质粒构建成功。质粒转染A549细胞后,RT-PCR结果表明,pSGFP-gal-GPI质粒在A549细胞中成功转录了gal-GPI目的基因。3.pSGFP-gal-GPI质粒转染细胞的绿色荧光不均匀分布在细胞膜周围,免疫细胞化学分析表明重组融合蛋白表达在细胞膜上,Western-blot结果表明重组融合蛋白与人IgG有良好的免疫反应性;人新鲜血清对表达该表位的A549细胞具有明显的溶细胞效应。结论:1.成功构建肿瘤特异性启动子Survivin调控的、EGFP-GPI融合蛋白真核表达质粒pSGFP-GPI,且能在A549细胞膜上锚定表达EGFP-GPI融合蛋白,为构建锚锭表达型肿瘤疫苗奠定基础。2.成功构建肿瘤特异性启动子Survivin调控的、EGFP-gal-GPI融合蛋白真核表达质粒pSGFP-gal-GPI,且能在A549细胞膜上锚定表达包含α-gal模拟表位的EGFP-gal-GPI融合蛋白。本实验为探索肺癌及其它肿瘤的基因治疗和免疫治疗综合途径奠定了基础。