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研究目的:1、通过观察VEGI (Vascular Endothelial Growth Inhibitor)在创伤性脑损伤(Traumatic Brain Injury, TBI)后小鼠的血脑屏障调控作用,脑水肿抑制作用,以及神经功能的恢复改善情况,明确其在脑创伤的功能作用,并初步探讨其潜在作用机制。2、通过观察VEGI在VEGF-A (Vascular Endothelial Growth Factor A)所诱导的体外血脑屏障(Blood Brain Barrier, BBB)模型渗漏的抑制作用,上调紧密连接蛋白作用,并在形态学上进行确认,明确VEGI能够抑制VEGFR2受体的磷酸化从而抑制VEGF-A所造成的BBB渗漏,并初步探讨其在细胞水平的作用机制。研究方法:1、体内试验部分:本实验选用清洁级健康成年C57B1/6小鼠,随机分为实验组1(空白对照组)、实验组2(假手术组)、实验组3(单纯TBI组)和实验组4(TBI+VEGI组)。分组后,我们建立小鼠液压打击颅脑创伤模型,应用小鼠神经功能评分和Morris水迷宫评价其行为学功能,并应用尹文思蓝、免疫荧光技术对小鼠血脑屏障的渗漏、紧密连接蛋白、血管标记进行检测。2、体外实验部分:本实验利用C57小鼠的鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3构建体外血脑屏障模型,随机分为实验组1(空白对照组)、实验组2(VEGI组)、实验组3(VEGF-A组)和实验组4(VEGF-A+VEGI组)。分组后,我们利用所构建的血脑屏障模型,测量细胞的跨膜电阻值检测血脑屏障渗漏的程度,并利用免疫荧光技术、Western Blot技术测定紧密连接蛋白的表达程度,并利用跳跃探针式离子电导显微镜(Hopping Probe Ion Conductance Microscopy, HPICM)连续实时观测紧密连接的纳米级形态学变化。研究结果:1、体内试验部分:液压打击后,实验组3和实验组4的小鼠在遭受液压打击后,mNSS评分立即升高,在伤后12小时,两组间评分无统计学差异,但随着伤情的逐渐恢复,差异渐渐呈现。在伤后24小时,遭受创伤的实验组3小鼠评分高于实验组4(P<0.01),这种差异在受伤后的第7天消失。Morris水迷宫定位航行测试中,实验组3和实验组4中,TBI组的小鼠于第三天开始,与假手术组相比较出现了统计学差异,这种差异一直保持至第五天训练结束;Morris水迷宫空间探索测试中,实验组3和实验组4与实验组1和实验组2相比较之间存在着明显的统计学差异,其目标象限百分比均明显下降(P<0.01),实验组3和实验组4相比较也出现明显的统计学差异(P<0.01)。实验组3相比较实验组4的EB渗漏率明显更低(P<0.01)。免疫荧光也显示实验组3与实验组4之间,CLN5、Alb的表达存在统计学差异(P<0.01)。2、体外实验部分:体外培养的bEnd.3细胞得TEER (Ω·cm2)的所测值中,对照组、VEGI预处理组以及VEGI+VEGF组之间未见明显统计学差异,而VEGF组相对于对照组明显下降(P<0.01)。在HPICM连续24h观测中,空白对照组、VEGI预处理组、VEGI+VEGF组的bEnd.3细胞形态以及细胞间紧密连接基本未发生明显的形态学变化,然而VEGF组却在加入100ng/ml VEGF-A之后16h逐渐出现了紧密连接高度的降低,并随时间的推移这种高度的降低更加明显;并且,这种变化还体现在相对粗糙度的变化上(P<0.01)。免疫荧光检测中发现:VEGF-A可明显降低Claudin-5的表达(P<0.01),但这种抑制作用可被VEGI所抑制。在Western Blot检测中,可见,100ng/ml VEGF-A可明显降低Claudin-5、 Occlaudin的表达(P<0.01),但未对ZO-1的表达造成任何统计学上的差异。并且,相对于VEGF-A组,VEGI+VEGF-A组可明显抑制VEGF-A对Claudin-5、 Occlaudin的下调作用;VEGFR2上的pY1175位点的磷酸化可被VEGF-A激活,但VEGI对这种VEGF-A诱导的磷酸化具有抑制作用。研究结论:1、在体实验:VEGI可以抑制TBI后小鼠的继发性脑水肿、减轻血脑屏障的渗漏、上调紧密连接蛋白,发挥神经保护作用,从而改善小鼠脑神经功能及行为学指标,为开发VEGI治疗TBI后脑水肿提供了实验依据。2、体外实验:VEGI可以抑制VEGF-A所诱导的BBB体外模型的渗漏、上调紧密连接蛋白,我们首次利用HPICM观测到了bEND.3在VEGI/VEGF-A的作用下所表现的纳米级形态学变化,此外,我们还发现了VEGI能够抑制VEGFR2受体的磷酸化,为探索VEGI对血管内皮细胞的作用机制进行了探索。