论文部分内容阅读
随着基础建设需求的不断增大，混凝土材料被广泛应用于现代工程建设，但在长期服役过程中容易出现裂缝等局部损伤，严重可危及建筑结构安全和人民的生命财产安全。近年来，利用产脲酶微生物诱导钙沉淀修复混凝土裂缝的技术因其作用持久性和环境友好性受到国内外学者的关注。然而，目前已获得的产脲酶野生菌株和基因工程重组菌株的脲酶活性仍普遍较低，严重制约了微生物诱导钙沉淀修复混凝土裂缝技术的发展。因此，如何高效表达脲酶、提高脲酶活性成为亟待解决的问题。基于此，本研究拟通过分子生物学手段，构建不同来源脲酶基因簇的重组表达菌株，拟筛选并获得高脲酶活性的脲酶重组菌株。主要工作总结如下：
(1)枯草芽孢杆菌来源脲酶UreABC基因簇在大肠杆菌中异源表达。以大肠杆菌BL21(DE3)为底盘菌，成功表达了枯草芽孢杆菌来源脲酶UreABC基因簇。重组脲酶经SDS-PAGE和NanoLC-ESI-MS/MS质谱分析，证明目的蛋白的UreA、UreB和UreC亚基均成功表达，但UreB、UreC亚基多以不溶性包涵体形式存在。BL21/pET32aUreABC重组菌的脲酶活性为1.244±0.001mmol/(L·min)。
(2)枯草芽孢杆菌来源脲酶UreABC基因簇在枯草芽孢杆菌中的同源表达。采用同源重组方法将目的基因UreABC和UreABC(His-tag)亚克隆至表达载体pHT254，将重组表达载体pHT254UreABC和pHT254UreABC(His-tag)分别电转化枯草芽孢杆菌，获得重组菌株AS1/pHT254UreABC和AS1/pHT254UreABC(His-tag )。SDS-PAGE和NanoLC-ESI-MS/MS质谱分析结果表明，重组菌中表达的UreABC多为可溶性脲酶复合体。AS1/pHT254UreABC重组菌株的脲酶活性达到2.555±0.001mmol/(L·min)，比含有组氨酸标签的AS1/pHT254UreABC(His-tag)重组菌株高2.8倍，推测可能原因是组氨酸标签对亚基基团自组装形成脲酶复合体或对脲酶复合体的催化功能存在一定程度的影响。
(3)具有辅助蛋白的巴氏芽孢八叠球菌来源脲酶在枯草芽孢杆菌表达系统中高效表达。采用同源重组的方法将巴氏芽孢八叠球菌来源的脲酶基因簇UreABCEFGD亚克隆至含有强启动子的载体pHT254中，分别构建含有和不含组氨酸标签的两种表达载体pHT254UreABCEFGD(His-tag)和pHT254UreABCEFGD。另外，为研究脲酶基因顺序对催化活性的影响，采取相同策略，构建基因簇中UreD位置调整的表达载体pHT254UreABCDEFG和pHT254UreABCDEFG(His-tag)。将以上重组表达载体分别电转化枯草芽孢杆菌AS1，筛选获得四种重组脲酶表达菌株。其中，AS1/pHT254UreABCEFGD菌株的最高脲酶活性达44.51±0.002mmol/(L·min)，比含组氨酸标签的AS1/pHT254UreABCEFGD(His-tag)重组菌株高6.01倍，比目前已知分解尿素能力最强的S.pasteurii脲酶活性高1.91倍。然而，调整脲酶基因编码顺序后获得的重组菌株未检测到脲酶催化活性，推测可能的原因是翻译出的多肽链未形成正确折叠。
综上所述，通过对比研究不同脲酶资源在原核表达系统的酶活力，获得比野生S.pasteurii催化尿素水解能力高1.91倍的AS1/pHT254UreABCEFGD重组菌株，该重组菌在混凝土裂缝修复方面具有潜在的应用价值，本研究也为进一步获得适用于工业应用的脲酶高效工程菌株研发奠定基础。
(1)枯草芽孢杆菌来源脲酶UreABC基因簇在大肠杆菌中异源表达。以大肠杆菌BL21(DE3)为底盘菌，成功表达了枯草芽孢杆菌来源脲酶UreABC基因簇。重组脲酶经SDS-PAGE和NanoLC-ESI-MS/MS质谱分析，证明目的蛋白的UreA、UreB和UreC亚基均成功表达，但UreB、UreC亚基多以不溶性包涵体形式存在。BL21/pET32aUreABC重组菌的脲酶活性为1.244±0.001mmol/(L·min)。
(2)枯草芽孢杆菌来源脲酶UreABC基因簇在枯草芽孢杆菌中的同源表达。采用同源重组方法将目的基因UreABC和UreABC(His-tag)亚克隆至表达载体pHT254，将重组表达载体pHT254UreABC和pHT254UreABC(His-tag)分别电转化枯草芽孢杆菌，获得重组菌株AS1/pHT254UreABC和AS1/pHT254UreABC(His-tag )。SDS-PAGE和NanoLC-ESI-MS/MS质谱分析结果表明，重组菌中表达的UreABC多为可溶性脲酶复合体。AS1/pHT254UreABC重组菌株的脲酶活性达到2.555±0.001mmol/(L·min)，比含有组氨酸标签的AS1/pHT254UreABC(His-tag)重组菌株高2.8倍，推测可能原因是组氨酸标签对亚基基团自组装形成脲酶复合体或对脲酶复合体的催化功能存在一定程度的影响。
(3)具有辅助蛋白的巴氏芽孢八叠球菌来源脲酶在枯草芽孢杆菌表达系统中高效表达。采用同源重组的方法将巴氏芽孢八叠球菌来源的脲酶基因簇UreABCEFGD亚克隆至含有强启动子的载体pHT254中，分别构建含有和不含组氨酸标签的两种表达载体pHT254UreABCEFGD(His-tag)和pHT254UreABCEFGD。另外，为研究脲酶基因顺序对催化活性的影响，采取相同策略，构建基因簇中UreD位置调整的表达载体pHT254UreABCDEFG和pHT254UreABCDEFG(His-tag)。将以上重组表达载体分别电转化枯草芽孢杆菌AS1，筛选获得四种重组脲酶表达菌株。其中，AS1/pHT254UreABCEFGD菌株的最高脲酶活性达44.51±0.002mmol/(L·min)，比含组氨酸标签的AS1/pHT254UreABCEFGD(His-tag)重组菌株高6.01倍，比目前已知分解尿素能力最强的S.pasteurii脲酶活性高1.91倍。然而，调整脲酶基因编码顺序后获得的重组菌株未检测到脲酶催化活性，推测可能的原因是翻译出的多肽链未形成正确折叠。
综上所述，通过对比研究不同脲酶资源在原核表达系统的酶活力，获得比野生S.pasteurii催化尿素水解能力高1.91倍的AS1/pHT254UreABCEFGD重组菌株，该重组菌在混凝土裂缝修复方面具有潜在的应用价值，本研究也为进一步获得适用于工业应用的脲酶高效工程菌株研发奠定基础。