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流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,自20世纪初流感大流行暴发以来,几乎每年都有流感疫情的发生。近年来,除了引发季节性流感的H1N1、H3N2和B型流感病毒之外,一些跨越种属屏障的、新发禽流感病毒(包括H5N1、H5N6、H6N2、H9N2、H7N9和H10N8等)直接感染人,对人类健康造成了巨大威胁,因此,寻找有效的流感治疗措施十分重要。血凝素(Hemagglutinin,HA)是流感病毒表面重要的糖蛋白,也是诱导机体产生抗流感免疫的重要抗原,可以诱导机体产生保护性体液免疫。流感病毒感染或者流感疫苗接种所诱导产生的HA抗体主要针对HA头部,可以阻断病毒与唾液酸受体的结合,对机体起到保护作用,但此类抗体常常具有毒株特异性,不能有效抵抗新发或突发流感病毒的感染。近年来,研究者发现大量可以对不同型或亚型流感病毒产生交叉保护作用的抗HA广谱中和抗体。这类抗体主要靶向HA茎部的保守区域,也有少数靶向头部受体结合区以及其他保守区域,从而有效应对由HA抗原的高度变异所导致的免疫逃逸,对流感的防治具有重大意义。为筛选获得广谱抗HA抗体,本研究体外培养H5N1患者外周血B细胞,通过HA结合筛选、H5N1假病毒中和筛选及分子克隆技术,获得了功能性B细胞的抗体基因。随后利用293T细胞表达系统体外表达抗体,使用ELISA及假病毒中和试验筛选潜在的广谱抗体,并进一步鉴定了抗体功能,分析了抗体基因及功能域特点。本课题共筛选4例H5N1患者的6份PBMC标本,主要发现如下:1.成功培养3例H5N1患者不同时间点的4份外周血标本内的B淋巴细胞,发现4份标本中均存在能够分泌H5反应性IgG的B淋巴细胞,部分交叉结合H5和H7。2.从采集时间最早的2#样本(感染后12天)筛选获得124孔H5反应性B细胞,占培养总数的5.78%,其中,23孔可与H7交叉反应(占培养总数的1.07%),7孔对GX-H5N1假病毒的中和百分率在80%以上(占培养总数的0.33%),提示抗H5或H5/H7交叉反应性B淋巴细胞已存在于机体内,病毒感染后可被激活进入外周循环。3.3#和4#样本分别采集于感染后21天和18天,H5反应性B细胞各占1.3%和3.17%,6#样本采集于感染后357天,H5反应性B细胞占培养总数的0.63%,而H5/H7交叉反应性B细胞占H5-B细胞的80%。提示外周血中H5反应性细胞比率随愈后时间增加明显降低。H5反应性或H5/H7反应性B淋巴细胞可参与外周循环,感染后一年也能检测到。4.筛选获得44株H5反应或H5/H7反应性抗体,41株与H5和H7交叉反应,2株分别由VH1-69和VH1-2编码的广谱抗体具有体外中和效应。5.分析2#样本所得抗体基因使用频率,发现VH1-69和VH3-30基因占据主要优势。VH1-69编码的Ab2-12D5和Ab2-12G8识别HA茎部,与已报道的抗Group1 HA广谱中和抗体CR6261识别相似的抗原表位。两株抗体均具有VH1-69抗体特征性的识别HA茎部的IFY区域。Ab2-12D5可识别Group1不同亚型HA,对2009pdm H1N1,H5N1和H5N6具有广谱中和作用;而Ab2-12G8不具有中和活性,但可与Group1和Group2HA交叉反应,识别谱更广。两株抗体均可在体外诱导产生抗体依赖的细胞毒效应(ADCC)作用。6.从3#样本中获得VH1-2编码的广谱抗HA抗体:Ab3-32G7.1。该抗体可有效结合Group1不同亚型HA,并能够中和2009pdm H1N1,H5N1和H5N6毒株。7.2#样本中编码交叉反应性抗体的VH3-30基因CDR区变异程度不同,对H5、H7的亲和力不同。CDR3中的111位的长疏水区MIVGAVL,LCDR3的99位D可能参与对HA茎部helixA的作用,从而影响对H5及H7的结合。结论:1.广谱反应性抗HA抗体也能在H5N1患者体内发现,可识别HA茎部表位,具有中和活性或ADCC效应。2.H5N1病毒感染人可快速诱导机体产生广谱保护性抗体,这很有可能是机体记忆性B细胞被激活的结果。