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研究目的甲状腺相关眼病(thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)又名Graves眼病、甲状腺功能亢进突眼、内分泌眼病等,是graves病在甲状腺以外的表现,属于自身免疫性器官特异性疾病。大量研究认为,促甲状腺激素受体(thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)和胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R)是TAO的自身抗原,两者形成结构和功能的复合体,在TAO发病的分子机制中起至关重要的作用,但其余分子是否亦在TAO的病程中扮演重要角色,目前仍不清楚。本文第一部分采用第二代高通量测序中的转录组测序的方法,对甲状腺相关眼病患者和健康对照人群来源的眼眶脂肪结缔组织中的转录组信息进行提取和分析,探讨除TSHR和IGF-1R以外,其余可能参与TAO疾病发生发展的分子和信号通路。基于转录组测序分析结果,穿透素-3(Pentraxin-3,PTX3)在甲状腺相关眼病患者眼眶脂肪结缔组织中的表达高于健康对照组来源的眼眶脂肪结缔组织。PTX3属于长链穿透素家族,该家族还包括C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)和血清P蛋白(serum amyloid P component,SAP)。在系统性红斑狼疮、多发性硬化等其他自身免疫性炎症性疾病中,PTX3在疾病极早期就有较高浓度表达,灵敏度高于CRP和SAP,且PTX3在血清中的表达值与疾病的严重程度呈正相关,对疾病的预后有重要的启示作用。本课题组在之前的研究中发现,甲状腺刺激激素(thyroid stimulating hormone,TSH)可以作用于纤维细胞(Fibrocytes,Fc),刺激其高表达PTX3,这种效应是通过增加PTX3的mRNA稳定性达到的,且可以被抗炎药物和抗IGF-1R药物所阻断。本文第二部分计划在转录组测序的基础上,取TAO患者和健康人来源的眼眶脂肪结缔组织和血清样本,比较不同来源的组织和血清中PTX3的表达差异,探讨PTX3作为TAO潜在生物学标志物的可能性。日前,一项多中心、双盲、平行随机对照的临床试验证实了抗IGF-1R抗体teprotumumab对于TAO治疗的有效性和安全性,改变了TAO目前治疗局限于对症治疗的窘境。但teprotumumab产生作用的分子机制仍在进一步探索中。本文第三部分计划采用teprotumumab处理共培养的纤维细胞和Th1细胞,并用PMA等抗原加以刺激,观察II类主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,class II,MHCⅡ)和干扰素伽马(Interferon-γ,IFN-γ)的表达量变化等,了解teprotumumab对于纤维细胞抗原呈递作用和Th1细胞活化的影响及机制。研究方法1.对纳入的对照组和病例组眼眶脂肪结缔组织进行mRNA质量检测;符合要求的样本各5例进一步采用RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq)获得其转录组信息,得到原始数据Rawdata;2.对Rawdata进行基因表达定量和校正,得到两组间差异表达的基因Dif-gene;3.对Dif-gene进行基因本体分析(Gene Ontology Analysis,GO)和通路分析;4.根据得到的显著性GO条目,做功能树分析(GO-tree)。根据显著性信号通路做信号通路网络(Path-Act-Network)构建;5.选取表达丰度高、差异倍数有统计学意义的上调基因和下调基因各2个,在TAO患者和健康对照人群眼眶脂肪结缔组织上,通过Real-time PCR验证Dif-gene的差异表达。6.分别取TAO患者和健康对照人群眼眶脂肪结缔组织和其培养的成纤维细胞,通过Real-time PCR和免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)分别验证PTX3在细胞mRNA和蛋白层面的表达;7.分别取TAO患者和健康对照人群来源的血液样本,通过酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测样本中PTX3蛋白的表达;8.分别取TAO患者和健康对照人群来源的血液样本,在外周血纤维细胞培养环境中加/不加teprotumumab,通过Real-time PCR和流式细胞技术分别检测细胞表面MHCⅡ表达的变化;9.分别取TAO患者和健康对照人群来源的血液样本,在外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)培养环境中加/不加teprotumumab,细胞成熟后用P/I抗体加以刺激,流式细胞技术检测Th1细胞内IFN-γ产量;10.收集上述样本培养过程中的培养液,ELISA检测加/不加teprotumumab时培养液中IFN-γ的表达量;11.分别取TAO患者和健康对照人群来源的血液样本,在外周血单核细胞培养环境中加/不加teprotumumab,待细胞成熟后加入IFN-γ中和抗体,流式细胞技术检测纤维细胞表面MHCⅡ的表达。结果1.TAO患者和健康对照人群来源的脂肪结缔组织,转录组测序得到的原始数据质量评分均大于20,mappedrate最低为0.895,最高为0.931。数据主要来源于外显子区域。转录组测序共得到784个差异表达基因;2.PTX3等445个基因在TAO患者眼眶脂肪结缔组织中表达上调明显。CTHRC1等339个基因在TAO患者眼眶脂肪结缔组织中表达下调明显。差异具有统计学意义;3.细胞因子和细胞因子受体相互作用、趋化因子等19条通路在TAO患者眼眶脂肪结缔组织中上调明显;细胞粘附、细胞外基质受体等20条通路在TAO患者眼眶脂肪结缔组织中下调明显;4.差异表达的基因和信号通路主要涉及以下功能:炎症反应、免疫反应、疤痕修复、T细胞调节等;PTX3基因主要参与炎症反应、免疫反应等生物学过程。5.在TAO患者来源的眼眶脂肪结缔组织中,PTX3在mRNA和蛋白水平表达均高于健康对照人群;6.PTX3在TAO患者来源的血液样本中,表达高于健康对照人群;但TAO活动期和稳定期表达无明显差异。7.无论是否有抗原刺激,teprotumumab均可降低外周血纤维细胞表面的MHCⅡ基因水平和蛋白水平的表达。且这种效应在TAO患者和健康对照人群来源的外周血纤维细胞中均可观测到;8.Teprotumumab可明显降低Th1细胞内的IFN-γ水平,无论细胞来源于TAO患者或健康对照人群;9.Teprotumumab可明显降低细胞培养液中IFN-γ的蛋白水平,无论细胞来源于TAO患者或健康对照人群;10.当加入IFN-γ中和抗体处理后,外周血纤维细胞表面MHCⅡ的表达明显降低,且这种效应在TAO患者和健康对照人群来源的外周血纤维细胞中均可观测到。结论1.PTX3等基因可能与TAO的发生和进展过程相关。细胞因子和细胞因子受体相互作用、趋化因子通路可能参与了TAO的病理过程;TAO患者的炎症反应、免疫反应、疤痕修复、T细胞免疫活性等生物学过程增强。多种炎症相关基因和自身免疫相关基因在TAO患者来源的眼眶脂肪结缔组织中表达升高,再次证实TAO与自身免疫、炎症的相关性;2.炎性分子PTX3在TAO患者的眼眶脂肪结缔组织和血液中表达均增高,可能涉及了TAO的炎性进展过程,PTX3可能是TAO病程诊断和预后的潜在生物学标志;3.Th1细胞通过分泌IFN-γ,刺激纤维细胞表面MHCⅡ分子的表达,teprotumumab可减少Th1细胞分泌的IFN-γ并减弱纤维细胞表面MHCⅡ分子的表达;4.Teprotumumab可减弱抗原刺激时Th1细胞的活化效应,并减弱纤维细胞的抗原呈递作用,这种效应在TAO患者和健康对照人群来源的外周血纤维细胞中没有明显差异。说明teprotumumab有效治疗TAO的机制,一部分可能是通过减弱Th1细胞和纤维细胞对自身抗体的免疫效应来实现的。