猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive andrespiratory syndrome,PRRS）是猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive andrespiratory syndrome,PRRSV）引起的一种病毒性传染病,给世界养猪业造成了重大经济损失,是猪病中最重要传染病之一。目前我国临床流行PRRSV复杂多样,多种类型毒株并存,不同类型病毒又很容易发生重组。在感染压力和外环境影响下,其基因序列易变异,继而造成PRRSV具有高度变异性和毒株多样性。因此,通过对临床流行毒株的序列测定和病毒分离,分析流行毒株序列变异特点和遗传演化,有助于及时发现新流行毒株的出现,为临床诊断和新型疫苗的研发提供参考依据。本研究旨在对2020～2022年间我国部分地区疑似感染PRRSV的病料样品进行分子检测,并对具有代表性样品的NSP2、ORF5基因和全基因组进行序列测定、遗传演化分析以及毒株的分离鉴定,以了解当前临床流行毒株的基因变异情况和遗传演化趋势。1.临床样品PRRSV分子检测及ORF5、NSP2基因序列测定分析本研究对1143份样品进行RT-PCR检测,共检出阳性PRRSV 186份,阳性率约为16.3%。根据样品来源猪场的发病情况、采集地点等选择有代表性的样品18份,用PRRSV分型引物进行分型,同时对NSP2、ORF5的基因序列进行扩增测定。最终获得NSP2、ORF5的基因序列各18条。分型结果显示,18份阳性样品中有15份样品为类NADC30,3份样品为HP-PRRSV。氨基酸分析结果显示,15份类NADC30样品的NSP2基因存在131个氨基酸的不连续缺失,与类NADC30毒株具有相同的缺失模式,其中4份样品有额外1～5个氨基酸的缺失;3份HP-PRRSV样品的NSP2基因存在30个氨基酸的不连续缺失与HP-PRRSV具有相同的缺失模式,无额外氨基酸的插入与缺失。基于ORF5基因的遗传进化结果显示,15份类NADC30样品中有5份位于Sublineage1.8分支,另外有8份位于Sublineage1.5分支,2份位于Lineage3分支;3份HP-PRRSV样品均位于Lineage8分支。由此可见,目前PRRSV临床流行毒株呈现多样化,同一样品ORF5、NSP2基因分析结果不同,因此对PRRSV流行毒株的基因序列分析有利于及时了解其变异情况。2.PRRSV的全基因序列测定及重组分析由于18份阳性样品的ORF5、NSP2基因分析结果存在差异,为了进一步探究这些序列间的遗传进化关系,通过对18份样品全基因组进行分段扩增测序,最终从15份类NADC30样品中扩增得到了13条全基因序列,从3份HP-PRRSV样品中扩增得到了2条全基因序列。2条HP-PRRSV全基因序列分析结果与NSP2、ORF5基因分析结果一致;13条类NADC30全基因序列中有4条全基因序列分析结果与NSP2、ORF5基因分析结果一致,另外9条全基因组分析结果与NSP2结果分析一致,与ORF5基因结果不一致。重组分析结果显示,15条全基因序列中有12条发生了基因重组,且这12份重组样品均为类NADC30。重组区域多发生在非结构蛋白和结构蛋白ORF2a～ORF6处,12条重组序列均以类NADC30毒株为主要亲本,本研究为后续重组毒株的致病性及分子特性研究等提供可靠的数据支持。3.PRRSV的分离与鉴定从18份样品中选取6份接种PAM细胞进行病毒分离,其中5份样品在接种PAM细胞3天后可观察到皱缩、聚集、破裂等细胞病变,收获细胞培养物继续传代。并对P3代细胞培养物利用436-F/436-R检测引物进行反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）鉴定,结果显示,有5份样品可扩增出特异性目的条带;利用N蛋白单克隆抗体进行IFA鉴定显微镜下能看到荧光。表明成功分离到5株PRRSV毒株。