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EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)属γ疱疹病毒亚科成员,可持续性潜伏感染于宿主细胞内,其感染与多种人类肿瘤发生有关,是公认的DNA肿瘤病毒。EBV相关胃癌(EBV associated gastric carcinoma,EBVaGC)是一种发病人数较高的EBV相关肿瘤,但其发病机制尚未明了。FOXO1转录因子是FOXO家族成员之一,目前研究表明FOXO1在多种肿瘤中表达下调,是重要的抑癌基因。PI3K-AKT为重要的细胞信号传导通路之一,通过影响下游效应分子的活化状态,在抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的过程中发挥关键作用,与人类多种肿瘤的发生发展密切相关。目前研究发现几乎所有病毒都可调控该细胞信号传导通路,以实现对宿主细胞的感染以及介导细胞转化。FOXO1是该通路的直接下游分子,含有3个保守的AKT磷酸化位点(Thr24,Ser256,Ser319),磷酸化的FOXO1被出核转运至胞质后降解,进而影响细胞增殖、凋亡、应激和存活等。目的:探讨EBVaGC中EBV对FOXO1转录因子表达的影响以及可能的作用机制,为进一步明确EBVaGC发生发展机制提供实验基础。材料与方法:(1)实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测EBV阳性胃癌细胞系(GT38,GT39,SNU719)和EBV阴性胃癌(EBV negative gastric carcinoma,EBVnGC)细胞系(BGC823,HGC27,SGC7901)中FOXO1及相关基因的转录表达。(2)亚硫酸氢盐基因组测序法(Bisulfite genomic sequencing,BGS)检测EBV阳性和阴性组胃癌细胞系中FOXO1基因启动子和第1外显子甲基化状态。(3)Western blotting检测EBV阳性和阴性胃癌细胞系中FOXO1及AKT蛋白表达;免疫组化技术检测EBVaGC和EBVnGC组织中FOXO1及AKT蛋白表达。(4)免疫荧光技术检测胃癌细胞系中FOXO1及AKT蛋白的亚细胞定位。(5)使用PI3K抑制剂LY294002作用于EBV阳性胃癌细胞系,检测FOXO1及AKT蛋白的表达变化。结果:(1)EBV阳性胃癌细胞系中FOXO1转录表达水平明显低于EBV阴性胃癌细胞系(t=7.101,P=0.0021);AKT1基因表达趋势与之相反(t=3.650,P=0.0218)。(2)BGS结果显示EBV阳性组和阴性组胃癌细胞系中FOXO1启动子区均呈低甲基化状态,无明显差异(t=0.96,P>0.05);FOXO1第1外显子区甲基化程度在两组细胞系之间也无明显差异(t=0.48,P>0.05)。(3)Western blotting结果显示,FOXO1蛋白在EBV阳性胃癌细胞系中表达较阴性组低(t=4.956,P=0.0077),而EBV阳性组胃癌细胞系中p-FOXO1(Ser256)蛋白表达则明显高于阴性组(t=6.097,P=0.0037);AKT蛋白在EBV阳性组胃癌细胞系中表达上调(t=3.267,P=0.0309),p-AKT(Ser473)在两组细胞系中均有表达。(4)免疫荧光检测结果显示,EBV阳性胃癌细胞系中FOXO1蛋白荧光强度较EBV阴性胃癌细胞系弱;在EBV阳性组胃癌细胞系(GT38,GT39,SNU719)和EBV阴性组胃癌细胞系(BGC823,HGC27,SGC7901)胞核和胞质中均可观察到FOXO1蛋白的表达,但EBV阴性胃癌细胞系BGC823和SGC7901中FOXO1蛋白主要分布于胞核。AKT蛋白荧光强度在EBV阳性组胃癌细胞系中较阴性组强,p-AKT(Ser473)蛋白在两组细胞系中均表达较弱;两组细胞系胞核和胞质中均可观察到AKT和p-AKT(Ser473)蛋白的表达。(5)免疫组化结果显示,EBVaGC组织中FOXO1蛋白表达较EBVnGC组织弱(χ~2=4.607,P=0.032),主要分布于胞核和胞质;而在EBVnGC组织中FOXO1蛋白主要位于细胞核内。EBVaGC和EBVnGC组织胞核和胞质中均可检测到AKT蛋白表达,EBVaGC组织中AKT蛋白表达较EBVnGC组织强(χ~2=5.063,P=0.024)。(6)LY294002作用于EBV阳性胃癌细胞系后,p-AKT(Ser473)蛋白表达明显被抑制,FOXO1蛋白的表达上调。结论:EBV在EBVaGC中可抑制FOXO1转录因子的表达,但EBV不诱发FOXO1基因启动子区和外显子区的高甲基化,FOXO1表达抑制不是由基因甲基化状态改变所致;FOXO1表达与AKT表达呈负相关,推测EBV可能通过PI3K-AKT信号通路磷酸化FOXO1,使其转运出核后降解,从而可能影响下游凋亡基因的转录,抑制细胞凋亡,促进肿瘤细胞的生长和增殖,进而参与EBVaGC发生发展。