丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是真核细胞中重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,介导了细胞外信号转导到细胞内的反应,从而调节细胞的生长、代谢、分化、凋亡、细胞存活、应激及炎症反应等多种重要的细胞生理和病理过程。在哺乳动物细胞中已发现14个MAPKs,共被分为4组。MAPKs的生物学功能主要通过磷酸化各种底物如转录因子和细胞骨架蛋白等而实现。目前,关于细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2),c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminal kinases,JNK)和p38各个亚型的研究最为广泛。在炎症刺激和应激时,细胞内的p38 MAPK信号通路发挥重要的作用。p38 MAPK家族包含4个亚型,分别为p38α,p38β,p38y及p38δ,分子量约为38～40 kD。不同的细胞外刺激将选择性激活不同的p38亚型,从而发挥不同的生物学功能。p38被激活后将磷酸化激活特异性底物,如多种转录因子和蛋白激酶等。p38 MAPK参与调控细胞生长、增殖、分化、衰老和细胞死亡等过程。同时,p38 MAPK还参与炎症和应激过程中转录因子的调控及细胞骨架重构,从而在多种疾病中发挥关键作用。p38调节激活的蛋白激酶(p38-regulated/activated protein kinase,PRAK)即MAPK蛋白激酶5(MAP kinase-activated protein kinase 5,MK5),于 1998年对MAPK蛋白激酶2(MAP kinase-activated protein kinase 2,MK2)进行同源序列分析时发现的。序列分析表明,PRAK由471个氨基酸残基组成,分子量约54 kD。在其结构中,同时含有一个核输出序列(nuclear export sequence,NES)和核定位序列(nuclear localization sequence,NLS),这二者使得PRAK蛋白能够在细胞质和细胞核之间相互穿梭。NLS结构域中还含有一个MAPK停泊位点(docking site),此位点介导了其与p38的相互作用。在哺乳动物内,PRAK广泛表达,但在心脏、骨骼肌、胰腺及肺脏中表达较高。细胞处于静息状态时,p38结合到PRAK的MAPK停泊位点处,从而使PRAK主要定位于细胞质中。但是过表达的PRAK主要存在于细胞核中。由于缺少PRAK特异性抑制剂,目前对于PRAK的激活机制及功能研究尚不全面。研究发现,PRAK的Thr182能被经典的MAPKs(p38 MAPK)和非经典的MAPKs(ERK3和ERK4)磷酸化并激活。激活的PRAK通过磷酸化并激活相应底物如热休克蛋白27(heat shock protein 27,HSP27)而发挥生物学作用。然而,在生理状态p38与PRAK的相互作用却受到质疑。早在1998年,体外实验证明重组的p38(p38α,p38β,p38γ,p38δ,)可以磷酸化激活PRAK。但随后研究发现,只有p38α和p38β能够在体内激活PRAK并调控PRAK的亚细胞定位。PRAK是MK家族中相对较新的一个成员,目前主要集中在其功能研究方面,但其激活及相关调控机制却知之甚少。为了进一步了解PRAK的相互作用蛋白及其生物学功能,我们课题组前期利用一种新型筛选相互作用蛋白的技术-T7噬菌体展示系统(T7 phage display system),利用GST-PRAK作为诱饵,筛选与PRAK相结合的蛋白。经过筛选发现,FAT10(HLA-F Adjacent Transcript 10)可能与PRAK有相互作用。FAT10是泛素样修饰因子(ubiquitin like modifiers,ULMs)家族成员之一。ULMs可以通过其羧基末端(carboxylterminal)甘氨酸与底物蛋白结构中的赖氨酸相结合,通过三个关键酶的级联反应发挥重要作用。目前已鉴定出十多种ULMs,其中对于NEDD8、SUMO和ISG15的结合过程研究比较清楚。FAT10编码基因位于I型人类主要组织相容性复合体(human major histocompatibility complex class I,MHC I)基因座。其结构中含有两个串联的泛素样结构域,且经过序列比对分析发现,这两个泛素样结构域均与泛素有30%相似性。FAT10只在哺乳细胞中表达,且在免疫系统如胸腺、淋巴结和脾脏等表达较高。研究发现,FAT10在成熟的树突状细胞和B细胞中表达明显升高,且内源性的FAT10可被干扰素γ(interferon 丫,IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)诱导表达。目前关于FAT10的性质及其功能研究尚不完善,研究发现虽然FAT10编码基因位于MHCI基因座,但是可能与抗原的递呈无关。且FAT10是一种短寿蛋白,半衰期约为1h,其在细胞内能够迅速被蛋白酶体降解,并介导与其融合蛋白的降解。目前关于FAT10功能研究主要集中在肿瘤和蛋白质降解两个方面。研究证实,FAT10在多种肿瘤细胞中均表达升高。其可能至少通过两种机制调控肿瘤的发生发展。一方面,FAT10可通过与有丝分裂阻滞缺陷蛋白2(mitotic arrest deficient 2,MAD2)结合,使染色质稳定性降低,从而促进肿瘤的发生发展。另一方面,FAT10还能够通过抑制β-Catenin的泛素化降解,促进肿瘤细胞的迁移、侵袭及组织转移。随着对其研究的逐步加深,Hipp等发现,与泛素类似,FAT10羧基末端含有双甘氨酸(Gly-Gly,GG)结构。此结构可与靶蛋白中的赖氨酸结合,并介导其被26S蛋白酶体系统降解。最新研究发现PRAK能够被26S蛋白酶体系统所降解。由于FAT10具有靶向蛋白质降解的功能,我们提出以下假设:FAT10可能通过其羧基末端GG结构与PRAK结构中的赖氨酸共价结合,此过程称为FAT10化;发生FAT10化的PRAK能够被26S蛋白酶体系统所识别,并使其降解。为了验证此假设,我们首先对FAT10和PRAK的体内外结合情况进行了研究,然后对PRAK的蛋白酶体降解途径进行了进一步验证。首先,我们在大肠杆菌株DE3中对GST-PRAK和His-FAT10进行了表达纯化,然后进行了离体结合实验。结果发现,结合在谷胱甘肽亲和树脂上的GST-PRAK能够将His-FAT10共沉淀下来,而在相同条件下GST蛋白却没有此作用。此外,我们将FAT10羧基末端的GG进行突变后发现,PRAK却不能将突变体沉淀下来,这说明PRAK在离体条件下能与FAT10结合,且此结合依赖于FAT10的GG结构。在体结合实验中,我们构建了带Flag标签的FAT10真核表达载体和带HA标签的PRAK真核表达载体。将二者共同转染至HEK293细胞中,使用抗Flag抗体的琼脂糖微粒进行免疫共沉淀能明显检测到二者的相互作用,并且在不同分子量处检测到PRAK复合物的产生。一旦FAT10羧基末端的GG发生突变,PRAK复合物消失。利用抗HA抗体的琼脂糖微粒进行免疫共沉淀结果与上述一致。由此可见,二者的相互作用以及复合物的形成依赖于FAT10的GG结构。为了鉴定PRAK蛋白中与FAT10相互作用的结构域,我们利用PRAK的无活性突变体PRAK(182A)、活性突变体PRAK(182D)、乙酰化位点突变体PRAK(364R)及PRAK激酶结构域PRAK(KD)和羧基末端结构域PRAK(CT)分别与Flag-FAT10共转染至细胞中,发现PRAK(182A)、PRAK(182D)、PRAK(364R)及PRAK(KD)均能与FAT10发生相互作用,且能明显形成复合物,与野生型PRAK组无明显差异,而PRAK(CT)与其结合作用明显减弱,且失去了形成大分子复合物的能力。这说明二者的相互作用及PRAK复合物的形成明显依赖于PRAK的激酶结构域。其次,我们构建了 CFP-PRAK和YFP-FAT10真核表达载体,将二者共转染至细胞中,使用TNF-α处理不同时间点后发现,过表达的PRAK和FAT10均主要定位在细胞核中,随着处理时间的延长,二者共同定位到细胞核内的某些小体中。而将FAT10羧基末端GG突变后,随着TNF-α刺激时间的延长,FAT10△GG表达逐渐减弱。由于FAT10本身受泛素蛋白酶体的调节,为了避免FAT10AGG的降解,在TNF-α刺激前使用MG132进行预处理。结果发现,抑制FAT10AGG的降解后,随着刺激时间的延长,FAT10△GG蛋白在细胞内弥散分布,且有明显积聚现象,但与PRAK无明显共定位。共转染PRAK和野生型FAT10组使用MG132预处理后,再使用TNF-α刺激与未使用MG132组相比没有显著差异,均能明显地检测到二者的共定位。然后,我们对PRAK蛋白半衰期进行了检测。结果发现,使用放线菌酮(cycloheximide,CHX)处理细胞后,随着时间的延长,PRAK由于被降解蛋白水平逐渐降低,其蛋白半衰期约为8 h。使用蛋白酶体特异性抑制剂一MG132处理后,PRAK的降解明显受到了抑制,半衰期明显延长。随后,使用MG132抑制PRAK的降解后,检测PRAK蛋白在细胞内的积聚情况。结果发现,使用MG132处理细胞后,PRAK特异性抗体可在不同分子量处左右检测到条带。如上所述,我们推测其为PRAK特异性复合物。同时,我们使用不同浓度的MG132处理细胞后,发现MG132浓度为5μmol/L时PRAKl00kD大小复合物开始出现(后续实验主要对此复合物进行研究),在20 μmol/L浓度时达最高峰。此外,我们还使用10μmol/L MG132处理细胞不同时间点观察此复合物的变化。结果发现此条带随着处理时间的延长逐渐增加,至9 h达到高峰。为了鉴定此复合物,我们使用PRAK特异性抗体进行免疫沉淀-银染-质谱鉴定。最后,我们使用MG132对细胞进行预处理,LPS或TNF-α刺激不同时间点后发现,一旦使用MG132,均能在100 kD处检测到PRAK特异性复合物,且此复合物随着刺激时间的延长逐渐增加。同时我们还发现使用MG132处理细胞后,p38 MAPK信号通路明显激活。随后我们对MG132诱导的MAPKs激活情况进行了检测。结果发现,单独使用MG132就能显著激活p38和ERK信号通路,而且与MG132处理有明显的时间和剂量效应。但MG132对于JNK信号通路并无明显影响。此外,我们分别使用p38和ERK信号通路抑制剂预处理细胞后,检测MG132诱导的p38和ERK信号通路的激活情况及PRAK特异性复合物变化。发现抑制p38信号通路后,MG132诱导的PRAK特异性复合物明显减少。而ERK信号通路抑制剂处理细胞后,MG132诱导的PRAK特异性复合物则无明显变化。通过上述研究,我们可以得出以下结论:1.PRAK和FAT10在离体和在体情况下均有相互作用。2.PRAK和FAT10的结合依赖于FAT10羧基末端的GG结构域及PRAK的激酶结构域。3.外源性的PRAK和FAT10主要定位在细胞核,细胞受到外来刺激时,二者能显著定位在细胞核内的某些小体内。4.PRAK是一个相对稳定的蛋白质,蛋白半衰期约为8 h。PRAK稳定性受蛋白酶体系统的调控,此过程可能与FAT10有关。5.MG132能够激活p38 MAPK和ERK信号通路,且p38 MAPK可能参与了MG132诱导的PRAK复合物的调控。