论文部分内容阅读
干旱是制约牧草生长发育和产量的主要逆境因素之一。研究牧草响应干旱胁迫的形态、生理反应以及分子机制,挖掘干旱应答基因,对牧草抗旱品种培育具有重要意义。扁蓿豆（Medicago ruthenica L.）属于一种抗寒、耐旱且适应性强的多年生豆科牧草,是研究豆科植物抗旱机制和挖掘抗旱基因的理想材料,同时也具备开发为优良牧草资源的潜力。本研究以土默特扁蓿豆为供试材料,02982和03056扁蓿豆种质为对照材料,在分析、对比3种材料对干旱胁迫形态学和生理学响应的基础上,利用转录组、小RNA和降解组测序技术,挖掘土默特扁蓿豆幼苗叶片中响应干旱胁迫的关键基因和mi RNA,探明与其相关的生物学途径。对研究结果中挖掘得到的mtr-mi R156b-5p及其靶基因进行初步分析,通过构建扁蓿豆瞬时表达体系探究mtr-mi R156b-5p和靶基因的相互作用,并利用生物信息学方法鉴定和分析靶基因SPL基因家族成员;在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中异源过表达扁蓿豆mtr-mi R156b-5p,探究其对本氏烟草形态和性状的影响。主要研究结果如下:（1）持续干旱胁迫处理下,3份扁蓿豆材料（土默特扁蓿豆,02982和03056种质）根冠长度比和根冠重量比均显著增加,株高胁迫指数、干物质胁迫指数和叶片相对含水量均显著降低,叶片脯氨酸和丙二醛含量随胁迫时间延续不断累积。其中,土默特扁蓿豆测定指标的综合表现优于其他2份材料,属优良抗旱种质。（2）对干旱胁迫（DS）和复水处理（RW）下土默特扁蓿豆的转录组进行测序分析和研究。无参考转录组分析结果显示:测序数据de novo从头组装共获得147957个转录本（Transcript）,组装成52457个单基因（Unigene）。之后对测序数据进行有参考转录组分析,比对到扁蓿豆参考基因组上的转录本共计33457个,其中获得GO和KEGG功能注释的基因分别为27402个和10297个。基因差异表达和功能分析结果表明,扁蓿豆干旱响应基因主要富集到缺水应答（GO:0009414）、甲壳素应答（GO:0010200）和伤害应答（GO:0009611）3个生物学途径,以及植物激素信号转导（ko04075）和MAPK信号级联途径（ko04016）两个通路。（3）对干旱胁迫（DS）和复水处理（RW）下土默特扁蓿豆的小RNA进行测序分析和研究。9个c DNA文库（CK＿1/2/3,DS＿1/2/3和RW＿1/2/3）共鉴定到属于92个mi RNA家族的669个保守mi RNA（Conserved mi RNA）和1089个新mi RNA（Novel mi RNA）,其中,mi R166和mi R171是成员最多的两个保守mi RNA家族。DS vs.CK、DS vs.RW和RW vs.CK三个比较组差异表达mi RNAs（differential expressed mi RNAs,DEMs）分别为141、36和111个,且各比较组下调DEMs数目显著多于上调DEMs。（4）对干旱胁迫（DS）和复水处理（RW）下土默特扁蓿豆的降解组进行测序分析和研究。3个降解组文库共鉴定到1099个mi RNA（包括523个conserved mi RNAs和576个novel mi RNAs）和5943个靶m RNA组成的9906个mi RNA-靶基因对,其中,ppe-MIR169i-p3＿2ss17GT19TG是土默特扁蓿豆中拥有靶基因数目最多的mi RNA。通过转录组-小RNA-降解组测序数据联合分析,构建了扁蓿豆干旱响应相关的mi RNA-靶基因-功能桑基图（Sankey Plot）和网络图（Network Plot）。（5）构建了扁蓿豆p NC-CAM1304-35S-mtr-mi R156b-5p过表达重组载体,并将其在扁蓿豆幼苗叶片中瞬时表达。利用q RT-PCR检测瞬时表达扁蓿豆叶片中mtrmi R156b-5p及其靶基因表达模式,发现evm.TU.original＿scaffold＿933＿pilon.102（SPL7）、evm.TU.frag Scaff＿scaffold＿126＿pilon.825（SPL13A）和evm.TU.original＿scaffold＿994＿pilon.229（LOC11432979）受mtr-mi R156b-5p负调控,且对mtr-mi R156b-5p可能存在反馈调节作用。（6）利用生物信息学方法从扁蓿豆基因组中共鉴定得到21个SPL基因家族成员,命名为Mru SPL1～Mru SPL21。21个Mru SPL基因分布于7条染色体（chr1、chr2、chr3、chr4、chr7、chr8和unanchor421＿1＿112456）上,且每条染色体上的Mru SPL基因数量不同。系统进化分析结果表明,Mru SPL基因家族成员可以分为9个亚家族（group 1-9）,相同亚家族成员的亲缘关系较近。Mru SPL家族成员的基因结构和保守基序分析结果显示,同一亚家族不同成员间的外显子个数、长度和分布以及保守motif类型和数量都具有较高的相似性,表明相同亚家族成员的基因结构保守性较强,所行使的蛋白功能可能较为相似。（7）构建了p ART-CAM-mtr-mi R156b-5p过表达重组载体,并转化本氏烟草无菌苗叶片外植体,最终获得21株转基因烟草阳性株系。其中,转基因烟草株系OE-11中mtr-mi R156b-5p表达量为对照植株的36倍。与本氏烟草相比,转基因烟草株系OE-11株高略高,茎略粗,分支较多,叶片颜色较浅,叶片数量明显增多,成熟叶片较小,现蕾期较晚。以上研究结果进一步补充和完善了扁蓿豆响应干旱胁迫的分子机制,为揭示扁蓿豆关键基因和mi RNA在响应干旱胁迫乃至非生物胁迫中的功能和机理奠定了理论基础。研究中鉴定到的扁蓿豆干旱相关基因和mi RNA不仅可以作为育种的早期判断指标,还可以为今后豆科牧草的抗逆育种提供新的思路和手段。