论文部分内容阅读
目的：流行病学研究发现,血清促甲状腺激素(TSH)水平与胰岛素抵抗正相关。然而,血清TSH水平与胰岛素抵抗之间存在相关性的机制目前尚不清楚。研究发现,促甲状腺激素受体(TSHR)不仅存在于甲状腺滤泡细胞表面,在前脂肪细胞和脂肪细胞表面同样检测到TSHR的表达。TSH可以直接与脂肪细胞表面的TSHR结合,发挥甲状腺以外的效应。TSH与TSHR结合后可促进已分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,通过环腺苷酸-蛋白激酶A(cAMP-PKA)途径分泌白介素-6。然而,升高的TSH是否同样会刺激脂肪细胞分泌肿瘤坏死因子-a(TNF-a),进而下调葡萄糖转运蛋白4 (GLUT4)表达和转位,导致胰岛素抵抗的发生,尚不清楚。本研究拟探讨TSH是否可促进3T3-L1脂肪细胞TNF-a的分泌,进一步影响脂肪细胞GLUT4表达和转位,参与脂肪细胞胰岛素抵抗发生的慢性非特异性炎症过程。方法:1.动物学研究：OLETF大鼠8只为糖尿病组(DM组),LETO大鼠8只为正常对照组(N组)。42周龄时目内眦取血,酶联免疫吸附法(ELISA)检测两组大鼠血清TSH水平。股动脉放血处死大鼠,Western blotting方法检测附睾脂肪组织TSHR、Phospho-NF-κBp65 Ser276、TNF-a、GLUT4的表达。2.细胞学研究：体外诱导3T3-L1前脂肪细胞为成熟脂肪细胞。①采用0.1mIU/ml牛TSH,分别刺激前脂肪细胞和诱导成熟的脂肪细胞,于刺激0-24h,采用ELISA方法检测培养基TNF-a水平,以观察TSH刺激后所产生的效应,以及产生效应的的最佳时间；②以不同浓度牛TSH (0.01mIU/ml 0.1mIU/ml 1mIU/ml)刺激后,检测培养基TNF-a水平,Real time PCR法检测细胞GLUT4 mRNA表达水平、Western blotting方法检测Phospho-NF-κBp65 Ser276的表达水平、GLUT4总蛋白及膜表达水平；③分别以1μM Forskolin及1mIU/ml牛TSH刺激后,检测培养基TNF-a水平；④检测予以1mIU/ml牛TSH刺激,及10μM H89预处理15分钟后,Phospho-NF-KBp65 Ser276蛋白表达水平、及培养基TNF-a水平,免疫共沉淀(Co-IP)法检测IκBα/PKAc复合物的产生；⑤给予Rapamycin 20nM预处理1h后,以1mIU/ml牛TSH刺激后,检测3T3-L1脂肪细胞GLUT4 mRNA表达水平及总蛋白及膜蛋白水平。结果：1.动物学研究：与N组相比,DM组大鼠血清TSH水平升高(P<0.01),DM组大鼠附睾脂肪组织TSHR、Phospho-NF-κBp65 Ser276、TNF-a蛋白表达水平升高(P<0.05,或P<0.01),GLUT4蛋白水平降低(P<0.01)；相关分析显示,大鼠血清TSH水平与附睾脂肪组织Phospho-NF-κBp65 Ser276、TNF-a蛋白表达水平均呈正相关(P<0.05),与附睾脂肪组织GLUT4蛋白表达水平及IAI均呈负相关(P<0.05,或P<0.01)。2.细胞学研究：①随着TSH刺激时间的延长,诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞培养基内TNF-a浓度呈上升趋势,刺激4h趋于达峰(P<0.05),但该效应未见于前脂肪细胞；②与空白对照组相比,随TSH刺激浓度的增加,培养基中TNF-a水平呈上升趋势(P<0.05)；③与1mIU/ml牛TSH刺激组相比,Forskolin刺激组培养基中TNF-a水平无明显变化(P>0.05)；④与空白对照组相比,予以10μM H89干预组培养基中TNF-a水平未见升高(P>0.05)；⑤随着TSH刺激剂量的增加,Phospho-NF-KBp65 Ser276蛋白表达水平呈上升趋势(P<0.05),H89可以抑制TSH对Phospho-NF-κBp65 Ser276蛋白表达促进作用,与培养基TNF-a水平的变化趋势相同,且予以1mIU/ml牛TSH刺激组,可以检测IκBα/PKAc复合物。予以10μM H89干预组未检出IκBα/PKAc复合物产生；⑥随着TSH刺激浓度的增加,GLUT4mRNA、总蛋白及膜蛋白结果呈下降趋势(P<0.05), Rapamycin可以逆转TSH对GLUT4 mRNA、总蛋白及膜蛋白的下调作用。结论：1.DM大鼠血清TSH水平及附睾脂肪组织TSHR的蛋白表达水平均高于N组,TSH与TSHR结合后可能会参与胰岛素抵抗发生的慢性非特异性炎症过程；2.TSH能够剂量依赖性地促进3T3-L1脂肪细胞TNF-a的分泌；3.TSH与3T3-L1脂肪细胞表面TSHR结合后,可能通过激活cAMP-PKA途径,产生IκBα/PKAc复合物,磷酸化IκB使其构象发生改变,活化NF-κB而诱导NF-κB依赖的TNF-a基因转录,促进TNF-a分泌,进一步下调GLUT4基因、蛋白的表达,并抑制其转位,有可能进一步参与胰岛素抵抗的发生。