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抗原特异性T细胞数量的多寡和功能的强弱能直接反映人体特异性细胞免疫的功能状态。但是检测方法少而复杂，比特异性抗体的检测困难许多。目前针对抗原特异性T细胞数量检测的金标准是pMHC多聚体荧光染色加流式细胞分析技术。但是pMHC单体及多聚体的制备技术复杂，国外的商品化产品种类少且昂贵，不呈系列，国内暂无，限制了其推广。而针对抗原特异性T细胞功能的检测，无论是传统的51Cr释放法、有限稀释法，还是普遍应用的ELISPOT法等，都各有其优势和缺陷。能否创建一种简单方便，易于推广、可同步检测抗原特异性T细胞数量和反应活性的新方法值得探索。 本研究将pMHC多聚体技术、人工抗原提呈细胞技术、磁性细胞分选技术以及ELISPOT技术整合于微孔反应板中，初步建立了磁性人工抗原提呈细胞微孔反应板技术(aAPC-microplate)，将数量、功能及系列化分析合为一体，简便易行，不需特殊仪器。H-2Kb-Ig/TRP2二聚体或H-2Kb-Ig/OVA二聚体被包被于细胞大小的磁珠表面，制成aAPC-beads，在包被了抗鼠IFN-γ抗体的96孔ELISPOT透明反应板中与定量的小鼠脾淋巴细胞共孵育，在板式磁场中洗去未与磁珠结合的细胞，显微镜下计数孔内剩余细胞，以检测混合淋巴细胞培养后的H-2Kb特异性的同种反应性T细胞或者OT-1鼠脾细胞中的OVA抗原特异性OT-1细胞的比例，而后继续培养孔中的剩余细胞24h，并补加多种抗原刺激物或者PHA，刺激孔内剩余细胞活化并分泌IFN-γ，经ELISPOT法检测之，显微镜下计数孔内的斑点数，计算孔内剩余细胞中分泌IFN-γ的细胞的比例，即抗原特异性T细胞的反应活性比。主要结果如下: 1.aAPC-beads的制备与表型分析:经PE-anti-mouse IgG1单抗荧光染色和流式检测证实:H-2Kb-Ig/肽二聚体能有效结合于磁珠表面，最佳包被剂量为3μg/2×105beads; BSA能有效封闭磁珠表面的剩余结合位点。当H-2Kb-Ig/肽二聚体与anti-CD28单抗等比例共同包被于磁珠表面时，构象特异性单抗PE-anti-H-2Kb的染色显示H-2Kb-Ig/肽二聚体在磁珠表面保持正确的空间构象;PE-anti-hamster IgG单抗染色显示anti-CD28单抗也同步被包被在磁珠表面。 2.H-2Kb同种反应性T细胞的数量检测:MLR组、BALB/c鼠单独培养组和C57BL/6鼠单独培养组的脾细胞作为待检细胞，在96孔细胞培养板中与H-2Kb-Ig/TRP2-beads共孵育和磁性分选，并在显微镜下计数与磁珠结合的细胞。结果显示:当被检细胞接种数量在1×104～10×104/孔范围内时，在MLR组、BALB/c单独组和C57BL/6单独组中，与磁珠结合的阳性靶细胞数占脾细胞数的比例（均值±SEM）分别为5.95％±0.90％、0.32％±0.13％和0.034％±0.015％，经直线回归方程校正后其比例分别为5.77％、0.29％和0.03％。同时，经典的H-2Kb-Ig/TRP2二聚体荧光染色并流式分析的结果为6.14％、0.32％和0.03％。收集MLR组经磁珠分选后孔内的剩余细胞群进行H-2Kb-Ig/TRP2二聚体荧光染色，流式分析结果显示阳性细胞比例上升至88.06％，CD3+T的比例也由分选前的49.16％上升到分选后的95.9％，提示该方法的特异性较好。 3.OVA特异性OT-1细胞的数量检测:OT-1鼠脾淋巴细胞作为待检细胞，在96孔细胞培养板中与H-2Kb-Ig/OVA-beads共孵育和磁性分选，并在显微镜下计数与磁珠结合的细胞。结果显示:当被检细胞接种数量在0.5×104～10×104/孔范围内时，两只OT-1鼠脾淋巴细胞群中与磁珠结合的阳性靶细胞数占脾细胞数的比例（经直线回归方程校正后）分别为18.76％和19.54％，而同时用H-2Kb-Ig/OVA二聚体荧光染色并流式分析的结果为19.22％和21.49％。收集经磁珠分选后孔内的剩余细胞数进行FITC-anti-Va2 TCR单抗的荧光染色和流式分析，结果OT-1细胞的比例由分选前的24.29％上升到分选后的83.03％，CD8+T细胞的比例也由分选前的48.29％上升到分选后的94.89％。 4.同步检测OVA抗原特异性OT-1细胞的数量和反应活性:该只OT-1鼠的脾淋巴细胞群经H-2Kb-Ig/OVA-beads分选和计数的结果与经典的pMHC多聚体荧光染色法检测的结果相近(14.95％ vs15.23％)，而传统的ELISPOT法的检测比例为19.74％;而后经三种不同形式和性质的刺激物刺激24h，分泌IFN-γ的细胞数占孔内剩余细胞数的比例称为OT-1细胞的活性比。PHA组、OVA+αCD28组和共包被H-2Kb-Ig/OVA和anti-CD28的磁珠组分别检测到的活性比为64.69％、50.77％和41.37％。 5.aAPC-microplate检测技术还有很多需要改进的地方;对数量检测和反应活性检测的准确性、特异性、重复性需要进一步验证，比如，以OT-1细胞为理想的待检靶细胞，系统地与pMHC多聚体荧光染色法、抗Vα2 TCR单抗荧光染色法以及传统的ELISPOT检测法相比较;后续还需设计实验评价方法的灵敏度和稳定性等。