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茶因富含多种有益的次级代谢产物,且具有独特的风味特征而广受消费者喜爱,其中茶氨酸的特异性积累已成为目前茶树次生代谢产物研究的热点之一,但公开报道的有关茶树体内茶氨酸合成的基因只有茶氨酸合成酶(CsTSl)。内生菌参与寄主体内次生代谢产物的合成,在其它植物中已被多次报道。茶树中存在着丰富的内生菌,但其在茶树体内茶氨酸合成代谢中的作用尚不明晰。因此,本研究以茶树不同品种组培苗为试材,在分离、鉴定茶树内生菌的基础上,初步探究了其合成茶氨酸的能力及合成机制,以及茶树体内和茶树内生菌中γ-谷氨酰基转肽酶基因(γ-GGT)和谷氨酰胺合成酶(TS/GS)在茶氨酸合成代谢中的作用。主要研究结果如下:1、以茶树品种“舒茶早”、“乌牛早”、“龙井43”、“云抗10号”和油茶品种“长林4号”的无菌组培苗为试材,从中分离得到茶与油茶内生菌。形态学及16S rDNA鉴定结果表明:四个茶树品种中分离得到的内生菌均属于罗丹诺杆菌科藤黄杆菌属细菌(Rhodanobacteraceae Luteibacter spp.),而油茶中分离得到的内生菌属于沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)。2、分别将茶树不同品种“舒茶早”、“乌牛早”、“龙井43”、“云抗10号”中分离得到的混合内生菌CsE-SCZm、CsE-WNZm、CsE-LJm、CsE-YKm,及油茶品种“长林4号”中分离得到的混合内生菌CoE-CLm进行体外培养,在外源添加终浓度为20 mM谷氨酰胺和20 mM盐酸乙胺后,持续培养7天。结果表明:CsE-WNZm培养物中茶氨酸的总产生量为 6.45 mg/L,其次 CsE-SCZm 为 4.87mg/L,CsE-LJm 为 4.18 mg/L,CsE-YKm为3.73 mg/L。以CsE-SCZm为例,进一步检测该内生菌所合成茶氨酸的胞外分泌效率,结果表明:内生菌所合成的茶氨酸,90%以上可被自主分泌到细胞外。而油茶内生混合菌CoE-CLm的培养液和菌体中,无论是否添加底物,均未检测到茶氨酸的产生。3、茶树及其内生菌GGT和GS(TS)的克隆、异源表达及酶活性分析。结果表明:茶树内生菌菌株中CsE7和CsE8中所获基因CsE7GGT和CsE8GGT体外表达的重组蛋白rCsE7GGT和rCsE8GGT,以20 mM谷氨酰胺和50 mM盐酸乙胺为底物的体外酶活力分别为431.86μkat/μg和299.17 μkat/μg,而茶树CsGGT2和CsGGT4体外重组蛋白rCsGGT2和rCsGGT4的酶活力分别是1.36μkat/μg和0.94μka/μg。数据显示:内生菌rCsE7GGT体外酶活力分别是茶树rCsGGT2和rCsGGT4的317.54倍和459.43倍,内生菌rCsE8GGT体外酶活力分别是茶树rCsGGT2和rCsGGT4的219.98倍和311.64倍。以茶树CsTS1为对照,体外重组蛋白rCsTS1的酶活为0.80μkat/μg,内生菌中谷氨酰胺合成酶CsE7GS和CsE8GS的体外重组蛋白rCsE7GS和rCsE8GS,以20 mM谷氨酸和50 mM盐酸乙胺为底物的体外酶活力分别为0.33 μkat/μg和0.49μkat/μg。数据显示内生菌的CsE7GS和CsE8GS也具有体外转化谷氨酸和盐酸乙胺为L-茶氨酸的能力,但酶活力均低于茶树体内CsTS1的酶活力。4、以茶树内生菌菌株CsE7为研究对象,分析了茶树内生菌将谷氨酰胺和不同氨基酸转化为茶氨酸的能力。结果表明:菌株CsE7对赖氨酸的转化效率最高(31.87μg/L),约是包括丙氨酸(9.67μg/L)在内的其他氨基酸的3倍左右。