链格孢菌(Alternaria alternata)是一种常见丝状真菌,广泛地分布在世界上各个角落。作为植物病原真菌,链格孢菌可以侵染多种农作物,如番茄、苹果、小麦、烟草等,引发严重的病害,经常会造成巨大的经济损失,甚至会威胁到人类的身体健康。目前为止,用于防治链格孢菌的化学农药的残留会导致环境污染、动物与人类中毒与诱导耐药性增强等严重问题,因此寻找无毒易降解的新型农药一直是研究热点。除了引发植物病害,链格孢菌在生长过程中还可产生一些有益的高值代谢产物。为了大规模生产这些化合物,需要建立起链格孢菌的发酵条件。大部分链格孢菌的致病机理与生产高值化合物的原理现在仍不清楚。通过对其代谢网络进行分析可以确定重要代谢产物生成过程中的关键酶,为链格孢菌的深入研究打下良好的基础。本实验设计与研究包括了以下几个方面:1.本章旨在筛选用于防治链格孢菌的新型绿色农药。此部分计算了不同浓度的壳聚糖对链格孢菌的抑制效果,然后进行了毒力测定,得到壳聚糖的EC50为450μg/mL,并粗略计算了将壳聚糖用于大量施用的成本。结果证明,壳聚糖对链格孢菌有一定的防治效果,并可作为价格低廉的农药使用。2.本章通过在不同转速、不同培养基、不同碳源的情况下观察并测定菌体的生长情况,成功得到了链格孢菌的最佳发酵条件。在避光、28℃、转速120 rpm,并使用以蔗糖为碳源的液体土豆培养基的情况下,发酵效果最好,成本也相对较低。3.目前对于链格孢菌抑菌机制与合产有益化合物的原理尚不明确,有待进一步研究。本章首先对链格孢菌的代谢网络进行了分析,找到了该菌中鞘氨醇的合成、分解途径和细交链孢菌酮酸的合成途径。接着确定了代谢通路中的限速酶SPT、SPHK和AHAS。之后对SPT与AHAS对应基因进行了同源性分析,得到了 SPT与AHAS相关基因的保守性。然后使用构建的进化树,找到了链格孢菌的近缘真菌。最终通过该近缘真菌基因的同源比对,发现一段链格孢菌中尚未报道过的基因很有可能就是编码SPHK的基因,并确定了其保守性。以上的生物信息学分析都为将来通过这几种酶对链格孢菌进行形态学与基因改造等进一步的研究奠定了基础。