阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种与年龄密切相关的神经系统退行性疾病。AD的典型病理改变是脑内出现高密度的老年斑、神经原纤维缠结及神经元的缺失。作为老年斑的主要成分,淀粉样β蛋白(A β)可以诱发神经炎症反应,伤害突触可塑性,进而使AD患者认知功能下降。Aβ的神经毒性作用机制十分复杂,目前还尚未彻底阐明。近年来,越来越多的研究表明异常AD与免疫应答相关。炎症反应存在于AD患者脑内,这可能是由于AD患者脑内的淀粉样蛋白以免疫原的形式引发了脑的非特异性免疫应答。免疫清除机制一旦被激活,从而引起了炎症反应。这种非特异性免疫应答涉及胆碱能神经元参与的变性反应。研究表明,A β1-42可以诱导神经炎症。在注射Aβ的脑区如海马,可有胶质细胞和炎性细胞因子数量的增加。此外,AD患者脑内也存在突触变性。有证据表明,在A β1-42不断聚集的过程中,突触的数量也在逐渐减少。我们实验室先前的研究也证实,海马内注射Aβ可明显伤害突触可塑性和动物的空间记忆功能。因此,AD发病机制的Aβ学说已经被广泛认可,Aβ的神经毒性作用机制以及拮抗其效应的研究已经成为目前AD研究领域的一个重要方向。脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)广泛分布于中枢神经系统,对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用,是目前最为认可的与突触可塑性、突触生长有关的神经营养物质。BDNF能防止Aβ引起的神经元死亡、凋亡,减轻神经元的病理状态。有研究发现,AD时顶叶皮层和海马部位的BDNF有明显减少。也有研究证实,BDNF在细胞水平可以完全逆转Aβ1-42引起的细胞伤害。这表明,BDNF的表达下调可能与AD的发生相关。我们推测：提高脑内BDNF表达水平,有可能对包括胆碱能神经元在内的神经元的存活、分化和生长起到积极作用,从而拮抗Aβ引起的神经元损伤和突触伤害作用,在一定程度上改善或提高AD患者的学习与记忆能力。然而,通过提高内源性BDNF以对抗A β1-42神经损伤的在体实验研究目前仍缺乏足够的实验证据。本研究采用腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)作为基因转移的载体,研究了在体AAV-BDNF表达对Aβ1-42所致的大鼠空间学习记忆伤害作用的生物学效应。AAV是单链DNA病毒,属于微小病毒科。由于AAV本身是一个天然缺陷型病毒,对宿主免疫原性弱,安全性好；同时AAV具有广泛的组织和细胞亲嗜性,并可在体内稳定地长时间表达外源性基因。因此,AAV是目前发展最有希望的载体之一。本实验运用在体行为学测试方法和电生理记录手段探讨了AAV-BDNF拮抗Aβ1-42的神经保护作用及其可能机制。实验研究分为两个部分：(1)运用Morris水迷宫行为学测试方法观察了AAV-BDNF对Aβ1-42所致空间学习记忆损伤的逆转作用；(2)利用在体大鼠海马CA1区场电位记录手段,观察了AAV-BDNF对Aβ1-42所致突触可塑性伤害的电生理效应。第一部分AAV-BDNF对Aβ1-42所致大鼠空间学习记忆损伤的保护效应观察目的：研究在体AAV-BDNF表达对A β1-42所致大鼠空间学习记忆伤害作用的生物学效应。方法：实验选用无视力和运动障碍的成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,将其随机分为四组：AAV+PBS, AAV+Aβ1-42, AAV-BDNF+PBS, AAV-BDNF+Aβ1-42。SD大鼠麻醉后,在立体定位仪的引导下,应用微量注射泵将AAV-BDNF,Aβ1-42或PBS等缓慢注射到双侧海马内。动物清醒后恢复三到四周,进行Morris水迷宫行为学测试。测试分定位航行实验、空间探索实验和可视平台实验三部分。主要观察指标为：对大鼠寻找水下平台的平均逃避潜伏期、平均游泳距离、撤去平台后大鼠在目标象限游泳时间和距离所占百分比。结果：(1)双侧海马各注射5μg Aβ1-42(AAV+Aβ1-42)显著降低了大鼠的空间学习与记忆能力。在训练第2-5天,大鼠寻找水下平台的时间和游过的距离明显延长(P<0.01)。例如,在第5天时,A β1-42组大鼠逃避潜伏期为72.38±2.62s,明显大于对照组(AAV+PBS)的16.05±3.21s(P<0.01)；空间探索实验中,Aβ1-42组大鼠在目标象限的游泳时间和距离明显小于对照组,如游泳时间占游泳总时间的百分比为25.03±1.56%,明显小于对照组的44.79±1.61%(P<0.01).(2) AAV-BDNF单独给予(AAV-BDNF+PBS)不影响大鼠的空间学习和记忆能力,与对照组相比无统计学差别(P>0.05)。(3)AAV-BDNF+Aβ1-42组中,大鼠逃避潜伏期明显小于Aβ1-42单独给予组(P<0.01)；目标象限游泳时间则明显大于Aβ1-42单独给予组(P<0.01)。(4)AAV-BDNF和A β1-42的单独使用及联合应用均未影响大鼠的视力和运动能力,各组游泳速度和逃避潜伏期均无明显差异(P>0.05)。结论：以上结果表明,双侧海马注射A β1-42严重损害了大鼠的空间学习记忆能力,而腺相关病毒转染BDNF可拮抗A β1-42引起的学习记忆能力损伤。这一结果提示,脑内BDNF的高表达有可能在AD等神经退行性疾病的预防和治疗中发挥积极作用。第二部分：AAV-BDNF对Aβ1-42所致海马突触可塑性伤害的电生理效应观察目的：利用电生理学在体场电位记录手段,观察分别或联合给予Aβ1-42和AAV-BDNF时,海马CA1区突触可塑性的变化,探讨AAV-BDNF拮抗A β1-42所致空间学习记忆损伤的可能电生理学机制。方法：将成年雄性SD大鼠麻醉后,固定于脑立体定位仪上。将绑定的双电极(刺激电极和记录电极)按解剖学位置插入到海马内。通过刺激(单刺激,强直刺激,双脉冲刺激)海马Schaffer侧枝,在海马CA1区诱发和记录基础的fEPSPs、fEPSP的长时程增强(long term potentiation, LTP)以及双脉冲易化(paired pulse facilitation, PPF)。结果：(1)与正常对照组(AAV+PBS)目比,AAV-BDNF单独给予(AAV-BDNF+PBS)没有影响海马LTP。其在给予HFS后Omin,30min,60min时分别为：183.66±4.36%,153.06±1.85%和145.07±2.14%；(2)A β1-42(AAV+Aβ1-42)明显压抑了海马LTP, HFS刺激后Omin,30min,60min, fEPSPs的平均斜率分别为151.57±6.90%,126.69±4.83%,117.18±2.77%(P<0.01)；(3)AAV-BDNF明显逆转了Aβ1-42引起的LTP压抑效应,在HFS刺激后60分钟时,联合给予AAV-BDNF和Aβ1-42组的fEPSPs平均斜率由A β1-42单独处理组的117.18±2.77%增加到143.77±3.06%；(4)各组PPF均不受各种药物的影响。结论：海马内注射A β1-42可明显压抑HFS引起的LTP；海马内单独注射AAV-BDNF不影响海马LTP,但AAV-BDNF预处理可以有效逆转A β1-42引起的LTP压抑；A β1-42与AAV-BDNF对突触可塑性的影响主要是通过突触后机制实现的。以上两部分实验初步证实了我们的假设：提高脑内特别是海马内的BDNF表达水平能够保护大鼠空间学习记忆功能免受Aβ引起的伤害,而海马突触可塑性的正常维持可能是BDNF改善学习记忆行为的一个重要的电生理机制。目的：抑郁和行为脱抑制是老年人尤其是阿尔茨海默病(AD),也是AD发病风险因素之一。已有实验证实,淀粉样β蛋白(Aβ)参与了AD患者脑内神经退行性变过程,与认知功能下降密切相关。但Aβ是否直接影响焦虑和抑郁行为及其可能的突触机制尚不清楚。方法：本研究联合采用高架十字迷宫、强迫游泳及电生理实验技术,观察了海马内注射Aβ1-42寡聚体对大鼠焦虑、抑郁行为及海马突触可塑性的影响。结果：与对照组相比,Aβ1-42组大鼠在高架十字迷宫开臂中停留的总时间明显延长、强迫游泳测试不动时间明显增加、在体海马长时程增强(LTP)受到明显抑制。结论：海马内注射Aβ可导致大鼠行为脱抑制、引起抑郁样行为并伤害突触可塑性,提示海马LTP的异常不仅影响学习记忆功能,可能也与焦虑和抑郁等精神行为异常的发生有关。