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CENP-E是一个重要的纺锤体检查点(Spindle assemble checkpoint, SAC)蛋白。SAC通过监控染色体正确分离而达到保持染色体数目的稳定性的作用[1],且对细胞周期和肿瘤发生有重要作用。通过查阅Genebank数据库查询发现CENP-E有两种不同形式的mRNA序列,分别命名为CENP-EWT和CENP-EⅠ,其中CENP-EⅠ缺失第38个外显子。有文献报道HeLa细胞表达CENP-EⅠ[2],本课题组前期实验中发现HeLa细胞中还存在不缺失CENP-E第38个外显子的mRNA,即CENP-EWT。因此在同一细胞内CENP-EWT和CENP-EⅠ是否同时存在,哪种形式更占优势,在肿瘤细胞和正常细胞中它们的存在是否存在差异,DNA水平上是否也存在缺失突变,二者的功能是否有区别,这些问题的解决将有助于我们进一步研究CENP-E在纺锤体检查点中的功能。本研究利用巢式PCR技术检测不同种类细胞株及癌组织和癌旁组织中CENP-E在DNA和mRNA水平上的存在形式及表达情况,首次发现在同一种细胞内同时存在着CENP-EWT和CENP-EⅠ两种mRNA形式,CENP-EⅠ还与细胞的恶性程度有一定的相关性,但是CENP-E在DNA水平上并不存在缺失;接着成功构建了针对CENP-E两种mRNA形式的干扰质粒,结果显示将CENP-EWT干扰后能提高细胞的恶性程度,从而为进一步研究CENP-E在肿瘤发生中可能起到的作用及肿瘤的临床治疗提供了新的思路。第一部分两种CENP-E mRNA形式在不同肿瘤组织中的表达差异目的:1.分析Hela细胞中两种CENP-E mRNA形式的表达情况。2.分析13种细胞株(U251、HepG2、LO2、786-0、OS-RC-2、HEK293、BIU-87、T24、SW480、HCT116、A549、MDA-MB-231和MCF7)和9种肿瘤(肝细胞癌、鼻咽癌、肾透明细胞癌、膀胱癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌和食管癌)癌组织及相应的癌旁组织中两种CENP-E mRNA形式的表达情况。3.研究基因组DNA是否存在CENP-E第38个外显子缺失。方法:1.采用巢式RT-PCR方法,以Hela细胞总RNA为模板,分析Hela细胞中两种CENP-E mRNA形式的表达情况。2.采用巢式RT-PCR方法同时扩增两种CENP-E mRNA,分析二者在不同细胞株及在癌组织和相应的癌旁组织中的表达量是否存在差异,该差异是否具有统计学意义。3.采用巢式PCR方法扩增上述不同细胞株及癌组织和相应的癌旁组织的基因组DNA,分析CENP-E在DNA水平上是否存在第38个外显子缺失。结果:1. Hela细胞中同时存在着两种CENP-E mRNA形式。2.两种CENP-E mRNA形式在不同细胞株及在癌组织和相应的癌旁组织中的表达量的确存在差异,且这些差异均具有统计学意义。3.在上述不同细胞株及癌组织和相应的癌旁组织的基因组DNA中没有发现CENP-E缺失突变现象,且差异没有统计学意义。结论:同一细胞内存在两种形式的CENP-E mRNA,第38个外显子缺失存在于RNA水平而非DNA水平, CENP-EⅠ可能与肿瘤有关。第二部分构建并筛选针对CENP-EWT的干扰质粒目的:1.构建针对CENP-EWT的短发夹状RNA(shRNA)表达载体。2.筛选能有效地干扰CENP-EWT的质粒和最佳转染体系。方法:1.设计、合成针对CENP-EWT的shRNA序列,与载体pgenesil-1连接,构建靶基因的shRNA重组表达质粒。2. shRNA重组质粒转染NK293细胞后,用PCR检测CENP-EWT表达量的变化,筛选有效的干扰质粒和最佳转染体系。结果:1.成功构建针对靶基因的shRNA重组质粒。2.设计的干扰序列中pshRNA-CENP-E-1和pshRNA- CENP-E-4是有效的干扰质粒,将二者共转染72h后NK293细胞中CENP-EWT的内源性表达受到明显抑制,表达量显著降低。结论:成功设计、合成并构建、筛选出了针对CENP-EWT的有效的shRNA重组质粒和最佳转染体系,在NK293细胞中能有效抑制靶基因的表达,为下一步的研究奠定了坚实的基础。第三部分干扰两种CENP-E mRNA形式后对细胞的影响目的:1.了解干扰两种CENP-E mRNA形式后对HepG2和LO2细胞增殖的影响。2.了解干扰两种CENP-E mRNA形式后对HepG2和LO2细胞周期的影响。3.了解干扰两种CENP-E mRNA形式后对HepG2和LO2细胞染色体分离的影响。方法:1. MTT法制备细胞生长曲线,检测基因抑制后对细胞生长的影响。2. FCM检测细胞周期的变化,检测基因抑制对细胞周期的影响。3.测定细胞分裂指数和分析染色体核型,检测基因抑制对染色体分离的影响。结果:1. MTT实验发现有效干扰CENP-EWT后实验组细胞生长较对照组明显减慢,将两种CENP-E mRNA形式均干扰后减慢得更显著。2. FCM检测显示有效干扰CENP-EWT后G2/M期的细胞比例增加,将两种CENP-E mRNA形式均干扰后增加得更显著。3.细胞分裂指数测定结果示实验组中分裂期细胞所占比例增加;核型分析显示实验组中染色体数目异常细胞比例也显著增加。将两种CENP-E mRNA形式均干扰后增加得更显著。结论:有效干扰CENP-EWT后分裂期细胞增多、染色体数目异常细胞比率增加、细胞生长减慢,说明两种CENP-E mRNA形式对细胞增殖、细胞周期和染色体分离可能具有重要调控作用,成功构建CENP-EWT被抑制后观察染色体数目异常变化的体外细胞模型,为后期的临床研究奠定基础。