论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的严重危害全球养猪业重要的病毒性传染病之一。PRRSV感染的靶细胞主要为肺泡巨噬细胞等免疫细胞,常导致动物机体发生免疫抑制,并促进其他病原的共感染。因此,深入研究PRRSV的致病机制对于研发新型疫苗和抗病毒药物具有重要意义。近年来对RPRSV的致病机理进行了多方面的深入研究,但对于该病毒与宿主细胞之间的相互作用机制以及病毒免疫逃逸机制尚不完全清楚。最新的研究发现PRRSV感染可以显著诱导细胞发生自噬,并能促进自身复制,但却未能解释具体的分子调控机制。TRIM28又称KAP1,是TRIM家族的成员之一。已知TRIM28是一个具有多种生物学功能的核蛋白,具有转录抑制因子活性和E3连接酶活性。最新的研究表明,TRIM28还能参与调节病毒复制和细胞自噬发生。但TRIM28是否在PRRSV感染过程发挥作用尚未有报道。利用Marc145细胞系为模型,我们发现PRRSV感染诱导细胞自噬产生时,可显著增加细胞浆提取物中TRIM28(KAP1)的蛋白水平,但却不影响TRIM28的mRNA表达。进一步利用免疫荧光和胞核胞质分离实验证实PRRSV感染可导致TRIM28从细胞核转移到细胞浆。通过构建PRRSV非结构蛋白真核表达载体并进行瞬时转染筛选,发现PRRSV非结构蛋白Nsp4能够介导TRIM28的出核,并能与TRIM28发生共定位。免疫共沉淀实验进一步检测发现,Nsp4可以与细胞内源的TRIM28发生相互作用,表明PPRSV Nsp4可能通过与TRIM28的相互作用介导其从细胞核转位至细胞浆中。深入研究发现,PRRSV感染导致的TRIM28出核依赖于核转运蛋白CRMI。为了深入研究TRIM28及其核质转移在PRRSV感染中的作用,我们设计针对TRIM28基因的特异性siRNA。利用siRNA敲低TRIM28表达后,发现PRRSV诱导的细胞自噬受到显著抑制,提示TRIM28在PRRSV介导的自噬中发挥关键作用。深入分析TRIM28作用的分子机制,发现TRIM28能够与自噬早期关键分子Vps34相互作用,PRRSV感染则能增强TRIM28与Vps34的相互作用;而利用CRM1抑制剂LMB预处理细胞则显著降低TRIM28与Vps34的相互作用,提示PRRSV感染引起核蛋白TRIM28转移至胞浆并与Vps34相互作用。不仅如此,PRRSV感染促进自噬早期Vps34-Beclin1自噬复合物的形成,而敲低TRIM28则能抑制病毒感染导致的自噬调控蛋白Vps34与Beclin1之间的相互作用,表明出核的TRIM28能促进自噬上游复合物形成,进而促进病毒诱导的自噬发生。进一步研究表明,TRIM28表达能够增强Vps34的SUMO化修饰,敲低TRIM28则能降低Vps34的SUMO化修饰,表明TRIM28通过其E3连接酶活性,增强Vps34的SUMO化修饰,从促进Vps34-Beclin1复合物的形成。而TRIM28出核信号突变体更能增强Vps34的SUMO化修饰,进一步证实PRRSV感染导致的TRIM28出核是促进细胞自噬小体的关键步骤。综上所述,我们发现PRRSV感染过程中,非结构蛋白Nsp4可能通过与TRIM28相互作用介导部分TRIM28以CRM1依赖的方式从细胞核转移至细胞浆中。出核的TRIM28则作为E3泛素连接酶使早期自噬调控分子Vps34发生SUMO化修饰,进而增强Vps34和Beclin1之间的相互作用来调控细胞自噬体的形成。我们的研究揭示PRRSV诱导细胞自噬发生的一个全新分子机制,从蛋白翻译后修饰的新视角阐明了PRRSV与宿主细胞相互作用机制。本研究为深入理解PRRSV的致病机制和研发新型抗病毒药物提供重要理论基础。